强直性脊柱炎患者免疫球蛋白及细胞自噬的变化及相关性分析

叶文芳+刘健+黄永平+黄雄峰+王叙德+潘淳

【摘 要】目的：分析39例强直性脊柱炎患者和20例健康体检者的血清免疫球蛋白（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、SIgA、IgM）、淋巴细胞自噬蛋白Beclin1、自噬指标微管相关蛋白l轻链（LC3-Ⅱ）、磷脂酰肌醇三磷酸激酶（PI3K）、AKT、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），观察上述指标的变化并对其相关因素进行分析。方法：选取39例强直性脊柱炎患者为AS组，另设20例健康体检者为健康对照组，采用ELISA方法检测2组血清免疫球蛋白（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、SIgA、IgM），运用Western blot方法检测2组淋巴细胞自噬蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ、PI3K、AKT、mTOR的变化。结果：①2组

免疫球蛋白比较，IgA、IgG1、IgG3较健康对照组显著升高（P < 0.05或P < 0.01）。②2组细胞自噬相关指标比较，PI3K、mTOR较健康对照组明显升高（P < 0.05或P < 0.01）。③相关性分析结果显示，AS患者PI3K与LC3-Ⅱ呈负相关。④相关性分析结果显示，AS患者IgG1、IgG2、IgG3、IgG4与mTOR呈正相关，SIgA与Beclin1呈正相关。结论：AS患者存在体液免疫功能的紊乱和细胞自噬指标的变化，且各项指标存在一定的相关性。

【关键词】 脊柱炎，强直性；免疫球蛋白；自噬蛋白；自噬通路

Changes and Correlation Analysis of Immunoglobulin and Autophagy in Patients with Ankylosing Spondylitis

YE Wen-fang，LIU Jian，HUANG Yong-ping，HUANG Xiong-feng，WANG Xu-de，PAN Chun

【ABSTRACT】Objective：To observe the changes and analyze the related factors of serum immunoglobulin（IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，SIgA，IgM），lymphocyte autophagy protein Beclin1，LC3-Ⅱ，PI3K，AKT and mTOR in 39 patients with ankylosing spondylitis and 20 healthy subjects.Methods：Thirty nine cases of ankylosing spondylitis were selected as an AS group，and 20 healthy subjects were selected as a control group，using ELISA method to detect serum immunoglobulin（IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，SIgA，IgM） of the two groups，and using Western blot to detect the changes of Beclin1，LC3-Ⅱ，PI3K，AKT and mTOR.Results：①According to the comparison of immunoglobulin of the two groups，the levels of IgA，IgG1 and IgG3 in the AS group were significantly higher than those in the control group（P < 0.05 or P < 0.01）.②PI3K and mTOR of the AS group were obviously higher than those in the control group（P < 0.05 or P < 0.01）.③Correlation analysis showed that PI3K in the AS group was negatively correlated with LC3-Ⅱ.④Correlation analysis showed that IgG1，IgG2，IgG3 and IgG4 in the AS group were positively correlated with mTOR，and SIgA were positively correlated with Beclin1.Conclusion：There are changes of humoral immune function and autophagy index in patients with ankylosing spondylitis，and there is a certain correlation between the indexes.

【Keywords】spondylitis，ankylosing；immunoglobulin；autophagy protein；autophagy pathway

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种慢性进行性脊柱关节病，属于自身免疫性疾病。本病早期无特异性症状，可出现炎症性腰背痛和腰背部僵硬，晚期可发生永久性关节畸形。早期诊断有助于控制病情进展，减少致残率，对AS的治疗具有重要意义[1]。据报道，AS患者体内存在免疫球蛋白的异常[2]。笔者分别对20例健康体检者和39例AS患者的血清免疫球蛋白（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、SIgA、IgM）、淋巴细胞自噬蛋白Beclin1、自噬指标微管相关蛋白l轻链（LC3-Ⅱ）、磷脂酰肌醇三磷酸激酶（PI3K）、AKT、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）进行检测，并对各项指标进行分析，从免疫球蛋白和细胞自噬的新角度研究，希望能指导AS的早期诊断、治疗及预后。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2013年10月至2014年3月在安徽中医药大学第一附属医院住院的AS患者39例为AS组，其中男31例，女8例，男女比为3.9∶1；年龄15～65岁，平均（33.15±11.24）岁；病程0.08～40年，平均（6.51±6.86）年。20例健康对照组均选自同一时间的门诊健康体检者，男

14例，女6例；年龄20～65岁，平均（30.62±

9.07）岁。2组患者在性别、年龄等方面比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。

1.2 诊断标准 符合1984年美国风湿病学会（ACR）修订的纽约诊断标准[3]。

1.3 纳入标准 ①符合上述诊断标准；②患者知情同意，并签署知情同意书。

1.4 排除标准 ①合并心、肾、肝、肺、造血系统等基础疾病者；②伴有其他自身免疫性疾病等严重原发性疾病者；③不能配合治疗的精神病患者。

2 研究方法

2.1 ELISA方法检测IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、

IgA、SIgA、IgM 于清晨采集所有研究对象空腹肘静脉血10 mL，置普通采血管内，将标本放置于试管架上，在室温下静置2 h。随后，将标本放入水平离心机内3000 r·min-1离心15 min，用滴管分离出血清并放于-80 ℃冰箱中直至使用，避免反復冻融。各亚型免疫球蛋白的测定均采用ELISA试剂盒S进行，操作前将试剂在室温下平衡30～60 min。实验过程严格按照说明书进行操作。

2.2 Western blot方法检测Beclin1、LC3-Ⅱ、PI3K、

AKT、mTOR 室温下采集所有研究对象空腹静脉血10 mL于2个真空肝素钠抗凝管中，并加入与血液等量的淋巴细胞分离液，水平移动抗凝管，放入离心机内2000 r·min-1离心20 min，试管中云雾状层，为单个核细胞层，吸取该层，用等量的PBS冲洗两次后，放置于离心机内1500 r·min-1离心5 min，上述操作重复2次。沉于试管底部呈淡黄色者即为淋巴细胞，吸取该层存于EF管内，置于-80 ℃冰箱中保存，用于Western blot检测。采血、分离淋巴细胞的整个过程不得超过2 h，避免标本反复冻融[4]。

2.3 统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量资料以表示，采用Spearman相关性分析，分析数据之间的相关性。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 2组免疫球蛋白亚型比较 2组比较，AS 组IgG1、IgG3、IgA较健康对照组显著升高（P < 0.05或P < 0.01）。见表1。

3.2 2组细胞自噬相关指标比较 2组比较，AS组PI3K、mTOR较健康对照明显升高（P < 0.05或P < 0.01）。见表2。

3.3 AS患者细胞自噬蛋白与PI3K-AKT-mTOR信号通路相关性分析 AS患者PI3K与LC3-Ⅱ呈负相关，AKT、mTOR与Beclin1、LC3-Ⅱ均无相关性。见表3。

3.4 AS患者免疫球蛋白与细胞自噬指标的相关性分析 Spearman相关性分析结果显示：AS患者IgG1、IgG2、IgG3、IgG4与mTOR呈正相关，SIgA与Beclin1呈正相关；免疫球蛋白各亚型与LC3-Ⅱ、PI3K、AKT无明显相关性。见表4。

4 讨 论

AS是一种较为常见的自身免疫性疾病，以中轴关节、骶髂关节、外周关节及肌腱附着点的慢性炎症为特征。早期表现为腰背僵痛，晚期可发生脊柱强直以及严重功能障碍。王倩倩等[5-6]认为，可能有多种免疫炎症因子参与了AS的发病。免疫球蛋白是重要的免疫学指标，其异常对AS诊断、治疗和预防具有一定的意义。防止感染、防御异物是体液免疫的两大基本功能[7]。B细胞是体液免疫的重要执行细胞，其活化是机体产生保护性抗体的关键步骤[8]。人体执行体液免疫功能是免疫球蛋白，免疫球蛋白是由B淋巴细胞经抗原刺激而产生[9]。起主要作用的免疫球蛋白有IgG、IgM和IgA，它们是人体内重要的免疫抗体，免疫球蛋白在体内的水平可以反映体液免疫的情况[10]。细胞自噬是自我平衡的一个过程，通过溶酶体降解受损的细胞器及大分子物质的过程，它不仅对多种组织细胞具有保护作用，还可防止细胞坏死[11]。自噬功能的缺陷会增加自身免疫性疾病的发病[12]。BAFF主要作用于外周B淋巴细胞，通过其受体BAFF-R激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，进而促进各亚型免疫球蛋白的分化[13]。PI3K/Akt/mTOR信号通路参与了淋巴细胞增殖和存活[14]。此外，该信号通路在细胞自噬中也起着调节作用[10]。PI3K/Akt/mTOR信号通路是目前研究的热点之一。本实验结果显示，AS患者存在体液免疫功能的紊乱和细胞自噬指标的变化，且各项指标存在一定的相关性。

张凤等[1]研究发现，AS患者体内常存在免疫球蛋白含量的异常，这提示着AS患者存在体液免疫功能亢进。参与体液免疫的免疫球蛋白主要有IgG、IgA、IgM，其中IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，它是反映机体免疫水平的重要指标之

一[15]。人IgG有IgG1、IgG2、IgG3和IgG4共

4个亚类。有研究表明，自身免疫性抗体增多时，患者常伴有IgG1的升高[16]。这与临床实践相符，临床上IgG1升高的患者，常伴有自身免疫性疾

病[17]。IgG中IgG3活性最强[18]。在自身免疫性疾病过程中有显著性变化，它对疾病的选择治疗措施和干预药物有辅助指导意义[19]。IgG4是免疫球蛋白G中含量最低的一种亚型，其敏感性和特异性分别为95.1%和90.76%[20]。既往研究表明，AS患者存在血清IgG4水平升高[21]。有研究表明，IgA水平可以反映AS的疾病活动度。AS患者关节病痛加重时，IgA含量相对增加[22]。IgM是急性免疫炎症反应的指标，它出现时间早、存留时间最短[9]。IgM也是体液免疫应答中最早出现的抗体，不过目前研究较少[7]。

Beclin-1基因是最早发现的自噬基因，为自噬标记蛋白，参与自噬体膜形成过程[23]。微管相关蛋白轻链3（LC3）的表达强度与自噬活性密切相关[24]。LC3修饰泛素样蛋白的过程在自噬泡形成中至关重要[25-26]。LC3是自噬标志性蛋白，有

Ⅰ型和Ⅱ型之分，Ⅰ型向Ⅱ型的转化，为自噬小体形成的标志[27]。LC3-Ⅱ定位于前自噬体和自噬体，是自噬体特异性标记蛋白[28]。

PI3K/AKT/mTOR信号通路是重要的细胞内信号转导通路，是细胞自噬主要的发生机制[29]。PI3K是一种膜蛋白[30]，自噬体形成中，PI3K也具有重要的调控作用[31]。AKT是细胞生存的关键调节因子，PI3K活性的增加能促进AKT的活

性[32]。PI3K激活后，PIP2受到催化，生成PIP3，

激活AKT[33]。mTOR能调节细胞的生长与增殖，为细胞自噬负调控分子[28]。BAFF通过PI3K的磷酸化作用增加Akt和mTOR的表达[34]。

本研究发现，AS患者IgG1、IgG2、IgG3、IgG4与mTOR呈正相关，SIgA与Beclin1呈正相

关；PI3K与LC3-Ⅱ呈负相关。B细胞激活因子（BAFF）能诱导B淋巴细胞增殖、分化和分泌免疫球蛋白，增强体液免疫应答[14]。BAFF与BAFF-R的结合还可激活PI3K，从而活化AKT和mTOR，促进B细胞存活的信号通路[35-36]。有研究称，PI3K/Akt/mTOR信号通路的上游可能是BAFF/BAFF-R，BAFF/BAFF-R能促进B淋巴细胞存活、增殖、抗原呈递[14]。PI3K/AKT/mTOR信号通路与类风湿关节炎、骨关节炎等自身免疫性疾病密切相关，也是目前的研究热点[37]。体液免疫与PI3K/AKT/mTOR信号通路相关，AS患者细胞自噬与PI3K/AKT/mTOR信号通路也相关，当机体体液免疫增强的同时，PI3K/AKT/mTOR信号激活，细胞自噬受到抑制[4]。目前自身免疫性疾病细胞自噬的研究尚少，本文从免疫球蛋白和细胞自噬的新角度，加强对AS患者细胞自噬的研究，探究其与体液免疫的关系，研究AS的发病机制，希望为AS的治疗提供新思路。

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收稿日期：2017-01-01；修回日期：2017-06-20