结直肠癌患者粪便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化状态观察

何樱，黄维甄，欧阳考滨，袁霞

(惠州市中心人民医院，广东惠州 516000)

结直肠癌患者粪便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化状态观察

何樱，黄维甄，欧阳考滨，袁霞

(惠州市中心人民医院，广东惠州 516000)

目的 观察结直肠癌(CRC)患者粪便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化状态。方法 CRC患者50例(肿瘤组)、结直肠良性病变者50例(良性组)、健康体检者50例(正常组)，采用甲基化特异度PCR的方法检测各组粪便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化检出率，并分析其与CRC临床病理参数的关系。根据肠镜病理诊断结果进行验证，比较粪便p16INK4a、MGMT、RASSF1A单独及联合检测诊断CRC的敏感度和特异度。结果 肿瘤组、良性组、正常组粪便p16INK4a基因甲基化检出率分别为74%、28%、14%，MGMT基因甲基化检出率分别为56%、24%、12%，RASSF1A基因甲基化检出率分别为72%、20%、10%，肿瘤组分别与正常组、良性组比较，P均<0.05。p16INK4a基因甲基化状态与CRC分化程度、TNM分期、淋巴结转移相关，MGMT基因甲基化状态与CRC淋巴结转移相关，RASSF1A基因甲基化状态与CRC分化程度、TNM分期、淋巴结转移相关，P均<0.05。三者联合检测诊断CRC的敏感度为95.8%，特异度为83.4%，ROC曲线下面积为0.816(95%CI0.739%～0.894%)。结论 CRC患者粪便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化检出率明显高于结直肠良性病变者及健康体检者，联合检测上述指标有助于CRC患者的早期诊断及其生物学行为的判断。

结直肠癌；p16INK4a基因；MGMT基因；RASSF1A基因；基因甲基化

结直肠癌(CRC)是常见的恶性消化道肿瘤之一，有较高的发病率及病死率[1,2]。CRC早期未发生癌组织转移时患者5年生存率为90%，发生局部转移时患者生存率为68%，发生远处转移时患者生存率仅为10%[3～5]。早发现及早治疗能明显提高CRC患者的生存率[6]，近年发达国家的CRC患者5年生存率有所提高[7]。近年来，肿瘤的表观遗传学研究进展对CRC的诊断和治疗具有深远的意义[8,9]。有研究[10,11]表明，抑癌基因启动子区高度甲基化是抑癌基因失活的一个至关重要的机制。研究[12]发现，在多种肿瘤中均存在多个抑癌基因启动子甲基化水平明显升高，提示抑癌基因启动子甲基化水平能作为CRC诊断的分子标志物。自肿瘤组织中脱落的癌细胞及游离的DNA能稳定存在于CRC患者的粪便，因此提取粪便DNA、检查抑癌基因启动子甲基化水平能为CRC筛查提供新的可能[7]。本研究采用甲基化特异度PCR(MSP)技术检测CRC患者粪便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因的甲基化状态，并探讨其对CRC的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年10月～2015年10月惠州市中心人民医院收治的CRC患者50例(肿瘤组)，男26例，女24例；年龄65～72岁，中位年龄68.5岁。良性结直肠疾病患者50例(良性组)，男29例，女21例；年龄65～73岁，中位年龄69岁。健康体检者50例(正常组)，男23例，女27例；年龄65～71岁，中位年龄68岁。纳入标准：①CRC患者：年龄>65岁，肠镜下有阳性发现且病理活检证实为癌，包括腺癌、印戒细胞癌、类癌等；②良性结直肠疾病患者：年龄>65岁，肠镜下有除痔疮外的阳性发现，病理检查排除癌，包括腺瘤型息肉、增生性息肉等；③健康体检者：年龄>65岁，肠镜下除痔疮外，无异常发现者。排除标准：①有其他消化道恶性肿瘤病史；②具有心功能不全、严重心律不齐、精神异常等基础疾病，不能耐受、不愿意配合或接受结直肠镜检查者。

1.2 粪便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化状态观察 ①DNA抽提和PCR扩增：称取所有入选对象粪便标本200 g左右，根据QIAamp粪便DNA试剂盒说明书提取基因组DNA，用100 μL去离子水洗脱DNA，并用NanoDrop ND1000分光光度计检测DNA。利用普通PCR扩增管家基因β-actin，确定抽提的粪便DNA中人体基因组的质量及含量，引物序列见表1。PCR反应体系：上下游引物各1 μL，模板3 μL，Taq酶12.5 μL，加水补足至总体积25 μL。反应条件：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，63 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共35个循环，72 ℃、5 min。最后取10 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；取扩增成功的标本进行进一步甲基化修饰。②DNA修饰：取成功扩增管家基因的粪便DNA 1.5～2.0 μg，严格按照EpiTect Bisulfite Kit(Qiagen)说明书进行亚硫酸盐修饰并回收。通过亚硫酸盐修饰后，粪便DNA中未甲基化的胞嘧啶(C)将转变成尿嘧啶(U)，而甲基化修饰的胞嘧啶则保持不变，用50 μL的去离子水重新溶解修饰后的DNA样品，用于后续的MSP检测。③MSP检测：采用MSP技术检测CRC患者粪便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化状态。设计甲基化特异度PCR及普通PCR引物(见表1)。反应总体积为25 μL：TaKaRa Taq EX Hot Star Version(5 U/μL)0.25 μL，10×PCR Buffer(Mg2+)2.5 μL，dNTP Mixture(各2.5 M)2 μL，PrimerF 0.5 μL(10 μmol/mL)，PrimerR 0.5 μL(10 μmol/mL)，模板DNA 2 μL，蒸馏水17 μL。反应条件为：95 ℃、12 min，94 ℃、30 s，61 ℃(甲基化，M)/59 ℃(非甲基化，U)30 s，72 ℃、30 s，共35个循环，72 ℃、5 min。取15 μL反应产物进行琼脂糖凝胶电泳。

表1 p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因的引物序列、

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。不同组间p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因启动子甲基化检出率比较采用χ2检验，采用ROC曲线评估p16INK4a、MGMT、RASSF1A及3者联合对CRC的诊断价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组患者粪便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化检出率比较 肿瘤组、良性组、正常组p16INK4a基因甲基化检出率分别为74%(37/50)、28%(14/50)、14%(7/50)，MGMT基因甲基化检出率分别为56%(28/50)、24%(12/50)、12%(6/50)，RASSF1A基因甲基化检出率分别为72%(36/50)、20%(10/50)、10%(5/50)，肿瘤组分别与正常组、良性组比较，P均<0.05。

2.2 粪便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化状态与CRC临床病理参数的相关性 结果见表2。由表2可知，粪便p16INK4a基因甲基化与CRC分化程度、TNM分期、淋巴结转移相关(P均<0.05)，而与性别、肿瘤直径、肿瘤数量、肿瘤部位无关(P均>0.05)；MGMT基因甲基化与CRC淋巴结转移相关(P均<0.05)，而与性别、肿瘤直径、肿瘤数量、分化程度、肿瘤部位、TNM分期无关(P均>0.05)；RASSF1A基因甲基化与CRC分化程度、TNM分期、淋巴结转移相关(P均<0.05)，而与性别、肿瘤直径、肿瘤数量、肿瘤部位无关(P均>0.05)。

表2 粪便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化与CRC临床病理参数的相关性(例)

2.3 p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化检测诊断CRC的敏感度、特异度、ROC曲线下面积 p16INK4a基因甲基化诊断CRC的敏感度为64%，特异度为86%，ROC曲线下面积为0.765(95%CI0.681%～0.849%)；MGMT基因的敏感度为61%，特异度为79%，ROC曲线下面积为0.795(95%CI0.596%～0.784%)；RASSF1A基因的敏感度为70%，特异度为86%，ROC曲线下面积为0.795(95%CI0.713%～0.877%)；三者联合检测的敏感度为95.8%，特异度为83.4%，ROC曲线下面积为0.816(95%CI0.739%～0.894%)。

3 讨论

早期CRC患者多数能接受手术治疗，且预后较好[13]，而晚期CRC多数已发生转移，无法接受手术治疗，多需接受放化疗等保守治疗，预后较差[14]。对于早期癌变阶段的CRC患者进行手术治疗，术后5年生存率有望超过90%；而针对晚期患者，其5年生存率不足10%[15]。目前，我国年龄>50岁的老龄人口多达2.56亿，而具有CRC风险的人群超过1亿[16]。故对高龄人群进行大规模、全面结肠癌筛查，对于CRC的早期诊断、早期治疗，提高CRC患者的预后具有至关重要的作用。

癌胚抗原、潜血试验(FOBT)、钡剂灌肠、结直肠镜检查等是目前CRC的主要筛查手段，其中用于普查筛选的手段主要是粪便检查及影像学检查[17]。FOBT作为CRC的常规筛查手段，其具有简单方便及患者易接受等特点，但是其对CRC的诊断灵敏感度低、假阳性率高[18]。而结肠镜检查是侵入性检查，具有检查方式繁琐、耗时长、易引起并发症等特点，若作为常规普查方式，患者不易接受[19]。FOBT及结肠镜检查均不是作为CRC大规模筛查的有效手段。因此，寻找一种简单、敏感度及特异度高的CRC高危人群初筛指标，根据初筛结果对阳性人群采用结肠镜检查，这种CRC筛查方法避免了盲目大规模结肠镜筛查带来的弊端和可行性较差等缺点，同时也节约资源，提高了结直肠镜检查阳性率。大量证据表明，大量从结肠癌中脱落的CRC细胞能稳定存在于粪便，因此可以通过提取人群粪便DNA，检测肿瘤异常表达分子作为CRC筛查的分子标志物。

近年研究[17]表明，抑癌基因启动子区CpG岛的高度甲基化是抑癌基因失活的一个重要分子机制。不同抑癌基因的转录失活可导致不同后果，包括细胞周期、细胞凋亡、细胞黏附、DNA修复等。在CRC中有多个抑癌基因启动子区CpG岛呈现不同程度甲基化，从而导致基因转录沉默。p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因DNA甲基化在大部分CRC患者肿瘤细胞中都能检测到，且基因启动子甲基化检测相对容易。本研究发现，健康体检者、结直肠良性病变者、CRC患者粪便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化检出率呈递增趋势，提示从正常、良性病变到CRC，p16INK4a、MGMT、RASSF1A甲基化水平逐渐提高。相关性分析表明，粪便p16INK4a、RASSF1A甲基化均与CRC患者的肿瘤分化程度、TNM分期及淋巴结转移密切相关，而MGMT甲基化与CRC患者淋巴结转移密切相关，这在一定程度上提示p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因甲基化与CRC进展相关，对CRC患者的预后判断具有一定价值。本文结果还显示，p16INK4a、MGMT、RASSF1A单独检测诊断CRC的敏感度分别为64%、61%、70%，特异度为86%、79%、86%，RASSF1A的敏感度、特异度均较高，而p16INK4a和MGMT特异度较高、敏感度较低；而3者联合检测能明显提高CRC的诊断效能。上述结果提示，检测粪便p16INK4a、MGMT、RASSF1A基因有助于CRC患者的筛查，其作为一种无创的检测方法，在临床诊断中具有潜在价值，有望成为新型的辅助筛查CRC的分子标志物。

由于本研究的总样本数量有限，我们需扩大样本量以进一步验证本研究结果。同时，本研究年限较短，目前暂无粪便p16INK4a、MGMT、RASSF1A甲基化状态与CRC患者预后的关系，我们需跟踪本研究所纳入患者的5年生存率及10年生存率，定期收集本研究纳入患者的粪便标本，进一步探讨p16INK4a、MGMT、RASSF1A甲基化对CRC患者预后判断的临床价值和意义。

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Observation of p16INK4a, MGMT, and RASSF1A gene methylation in stool of patients with colorectal cancer

HEYing,HUANGWeizhen,OUYANGKaobin,YUANXia

(HuizhouMunicipalCentralHospitalofGuangdongProvince,Huizhou516000,China)

Objective To observe the gene promoter methylation of p16INK4a, MGMT, and RASSF1A in stool of patients with colorectal cancer (CRC). Methods Fifty healthy examined people (control group), 50 patients with benign colorectal disease (benign colorectal disease group) and 50 CRC patients (CRC group) were enrolled in the study. The p16INK4a, MGMT and RASSF1A promoter methylation detection rates in stool were detected by metilylation specific PCR (MSP). The correlation between p16INK4a, MGMT and RASSF1A promoter methylation levels and clinical parameters were analyzed by using statistic method. The sensitivity and specificity of p16INK4a, MGMT, and RASSF1A alone and in combination for the diagnosis of CRC were compared by using Bay's equation on the basis of pathological diagnosis.Results The detection rates for p16INK4a methylation were 74%, 28%, and 14% in the CRC group, benign colorectal disease group, and control group, 56%, 24%, and 12% for MGMT gene, and 72%, 20%, and 10% for RASSF1A gene, respectively. Statistically significant difference was found between the control group, benign colorectal disease group, and CRC group (allP<0.05). Additionally, correlation analysis showed that both p16INK4a and RASSF1A gene methylation was significantly associated with differentiated degree of CRC, TNM stage, and lymph node metastasis, while MGMT was correlated with lymph node metastasis (allP<0.05). The diagnostic sensitivity and specificity for combination of p16INK4a, MGMT, and RASSF1A was 95.8% and 83.4%, respectively. The ROC area under curve was 0.816 (95%CI: 0.739%-0.894%). Conclusions The methylation levels of p16INK4a, MGMT and RASSF1A in stool from CRC patients are significantly higher than those of patients with benign colorectal disease and healthy people. The combined detection of these three genes in stool is useful for early diagnosis of CRC and prediction of biological function of CRC.

colorectal carcinoma; p16INK4a gene; MGMT gene; RASSF1A gene; gene methylation

广东省惠州市民政局资助项目(20151116344)。

何樱(1978-)，女，副主任医师，主要研究方向为结直肠癌化疗的基础及临床。E-mail： 13928311788@163.com

袁霞(1971-)，女，主任医师，教授，硕士生导师，主要研究方向为恶性肿瘤的化学治疗、内分泌治疗、生物治疗、分子靶向治疗等。E-mail: yuanxia71@hotmail.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.31.003

R735.3

A

1002-266X(2017)31-0009-04

2017-04-03)