细胞块免疫细胞化学方法在非小细胞肺癌靶向治疗中意义的研究

张功亮，彭芳，王建，郭广秀，王志

(赣州市人民医院病理科，江西赣州341000)

·实验研究·

细胞块免疫细胞化学方法在非小细胞肺癌靶向治疗中意义的研究

张功亮，彭芳，王建，郭广秀，王志

(赣州市人民医院病理科，江西赣州341000)

目的为病人进行靶向治疗提供准确可靠、方便快捷检测方法。方法收集非小细胞肺癌患者细针穿刺、电子支气管镜刷检液和胸水病例40例。用细针吸取标本、电子支气管镜刷检液和胸水离心标本制作细胞块、HE染色和免疫细胞化学方法检测标本中的EGFR和ALK表达情况。结果40例细胞块免疫细胞化学结果：EGFR阳性15例（阳性率37.5%）；ALK阳性3例（阳性率7.5%）。结论细胞学可制备高质量的细胞块，能够为病人进行靶向治疗提供准确可靠、方便快捷检测方法。

细胞块；免疫细胞化学；肺癌；靶向治疗

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，死亡率居恶性肿瘤之首。我国肺癌发病率呈现逐年上升趋势。近年来，随着基因组学、蛋白组学的发展和大量靶向药物的研究和应用，肺癌的治疗已经从传统的标准化手术治疗模式走上了以基因为导向的个体化治疗之路[1]。

目前单纯的组织分型已不能满足肺癌个体化治疗的需求，随着生物技术的发展，对不同组织亚型的肺癌再进行EGFR和ALK蛋白的检测，根据肺癌驱动基因突变谱指导靶向个体化治疗已经成为了现实[2-5]。

肺癌病人，特别是晚期病人无法对原发灶进行活检，多以淋巴结转移、远处转移或胸腹水为表现的，我们通过细针穿刺、电子支气管镜刷检液和胸水离心细胞块免疫细胞化学方法检测EGFR和ALK，为病人进行靶向治疗指标的病人提供准确可靠、方便快捷检测指导靶向用药[6]。

我们收集我院非小细胞肺癌患者细针穿刺、电子支气管镜刷检液和胸水病例40例。用细针吸取标本、电子支气管镜刷检液和胸水离心标本制作细胞块、HE染色和免疫细胞化学方法检测标本中的EGFR和ALK表达情况。

1 资料与方法

1.1 临床资料收集赣州市人民医院医院病理科2014年7月-2015年12月间，在我院非小细胞肺癌患者细针穿刺、电子支气管镜刷检液和胸水病例40例。患者男性28例，女性12例，年龄41~77岁，平均年龄62岁，所有病例均无放疗、化疗病史。

1.2 细胞块的制备临床怀疑淋巴结转移性肺癌的患者，穿刺前应详细询问病史，仔细检查肿物位置，大小，硬度，活动度。穿刺时用左手固定肿物，右手持10ml注射器刺入肿物，保持针管内负压，快速提插10~30余次，以针尖斜面利刃对病变多次切割，并同时借助针管内的持续负压将切割获得的标本吸入针芯和针管内，当看到针芯有乳向色或血性成分抽出时既拔针，直接涂片2张，瑞氏染色作细胞学诊断[7-12]。

电子支气管镜刷检液和胸水，静置30min，倒去上清，取15ml液体离心，将沉渣涂片2张，瑞氏染色作细胞学诊断。

细胞块制作：⑴标本移出：借助空气压力将针管内的穿刺标本喷至载璃片上。⑵乙醇固定：用穿刺针将载玻片上的标本聚集成一小团，吸除多余的血液，将标本放置2~5min，然后连同载玻片浸入95%的乙醇中2min。再用穿刺针将载玻片上标本聚集成更小的团块，再次浸入95%的乙醇中2min，注意观察制做的团块应与载班片紧密连接，不从载玻片滑脱。⑶甲醛固定：将已经凝固在载玻片上的标本块移至盛有中性甲醛的固定液的器皿中固定2h。⑷用手术刀片水平角度从载玻片上切下、平移已经固定好的细胞块，至普通包埋盒和正常组织一样完成脱水和蜡过程。对细胞块进行石蜡包埋，连续切片，厚3～5μm，行常规HE染色和免疫组化标记。

1.3 免疫细胞化学方法免疫细胞化学试剂一抗采用福州迈新生物技术开发公司生产的EGFR和ALK。检测系统采用福建迈新公司的Elivision试剂盒。细胞块石蜡切片厚度3～4μm，60℃烤箱烤片1h，梯度二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，蒸馏水浸泡5min，3%过氧化氢室温孵育10min阻断内源性过氧化酶的活性，PBS液冲洗，高压锅抗原修复，自然冷却至室温。加入二步法Elivision试剂盒中试剂A，室温孵育20min，PBS冲洗3次，每次5min，加入试剂盒中试剂B，室温下孵育30min，PBS冲洗3次，每次5min。镜下控制DAB显色，蒸馏水冲洗终止反应。苏木素复染，盐酸酒精分化，自来水冲洗返蓝，脱水，透明，中性树胶封片，每次均做阳性对照及PBS代替一抗做阴性对照

1.4 结果判定免疫细胞化学判断的标准：定位准确，有棕黄色颗粒判读为阳性，EGFR阳性定位于细胞浆或细胞膜，ALK阳性定位于细胞质核旁：肿瘤细胞核阳性细胞数的比例＜10%为阴性，＞10%为阳性，结果判定采用双盲对照法观察。

2 结果

穿刺细胞学制作细胞块和电子支气管镜刷检液和胸水离心后制作细胞块检查获取的细胞量较多，并含有微小颗粒，保留部分组织结构，可制备高质量的细胞块(图1)，有助于做出细胞病理诊断。免疫细胞化学方法显示细胞分布较均匀，阳性着色部位准确，背景清晰（图2）。40例细胞块免疫细胞化学结果：EGFR阳性15例（阳性率37.5%）；ALK阳性3例（阳性率7.5%）。

图1 细胞块HE染色×200

图2 细胞块免疫细胞化学EGFR×400

3 讨论

EGFR是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，为cerbB(HER)家族中4个成员之一。非小细胞肺癌中EGFR突变率在在亚裔、女性、非吸烟、腺癌中EGFR突变率最高。针对EGFR的小分子酪氨酸激酶吉非替尼、厄洛替尼及埃克替尼。其有效性主要表现在对外显子19缺失或外显子2l L858R突变的肺腺癌治疗中[1，13，14]。

ALK位于2号染色体短臂发生异位重排，与EML4基因融合，形成具有癌基因属性的EML4-ALK，约有4%的非小细胞肺癌患者EML4-ALK融合基因阳性。患者多为年轻、男性、不吸烟或少量吸烟腺癌患者。目前针对该靶点的药物有Crizotini。

肺癌病人，特别是晚期病人无法对原发灶进行活检，多以淋巴结转移、远处转移或胸腹水为表现的，我们通过细针穿刺、电子支气管镜刷检液和胸水离心细胞块免疫细胞化学方法检测EGFR和ALK，为进行靶向治疗的病人提供准确可靠、方便快捷检测指标指导靶向用药[15]。

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R446.8，R734.2

A

1674-1129(2017)04-0479-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.04.007

2017-02-22；

2017-05-29)

张功亮，男，1960年生，副主任医师，从事病理诊断工作。

彭芳，女，1985年生，主治医师，硕士研究生，病理与病理生理学专业。