HPLC同时测定墨旱莲正丁醇有效部位含量分析

孔燕凌

(驻马店市第二中医院制剂室，河南驻马店463000)

HPLC同时测定墨旱莲正丁醇有效部位含量分析

孔燕凌

(驻马店市第二中医院制剂室，河南驻马店463000)

目的建立HPLC法定量同时分析中药材墨旱莲有效部位成分的方法，为墨旱莲的质量控制提供参考。方法根据临床文献对墨旱莲正丁醇提取部位活性成分药理筛选实验结果，确定墨旱莲正丁醇有效部位主要活性成分为（墨旱莲皂甙A、齐墩果酸、芹菜素、木犀草素、α-三联噻吩、(丁烯-3-炔-卜基)2，2-二联噻吩、蟛蜞菊内酯、去甲基蟛蜞菊内酯）。选择市售经鉴定的墨旱莲，采用经石油醚-乙酸乙酯-正丁醇提取步骤得到墨旱莲正丁醇有效部位，采用高效液相色谱法（HPLC）对其主要活性成分进行分离、同时检测。流动相组成：洗脱程序：。采用8种待测成分的对照品，对该HPLC方法检测8种成分的线性关系、加样回收率变异系数、日间精密度变异系数、重复率变异系数、稳定性变异系数进行分析，综合评价HPLC法定量分析墨旱莲有效部位8种成分的价值。结果采用上述HPLC条件检测墨旱莲正丁醇有效部位的8种活性成分，结果显示，8种成分墨旱莲皂甙A、齐墩果酸、芹菜素、木犀草素、α-三联噻吩、(丁烯-3-炔-卜基)2，2-二联噻吩、蟛蜞菊内酯、去甲基蟛蜞菊内酯的峰面积和浓度均呈线性关系，相关性系数均＞0.999，8种成分的加样回收率均＞98.0%，8种成分的日间精密度变异系数、稳定性、重复率变异系数均＜3.0%。结论HPLC法同时测定墨旱莲有效部位的8种活性成分具有较好的稳定性，可重复性好，回收率高。为墨旱莲有效部位活性成分的质量控制提供了量化手段，是适合墨旱莲临床主要以有效部位作为临床应用的特性，具有较高的应用价值。

高效液相色谱；墨旱莲；有效部位；活性成分；质量控制

墨旱莲是民间俗称的旱莲草、猪牙草，为菊科植物鳢肠的全草，夏、秋采收全草，清洁晒干或阴干即可入药，无需特殊炮制。墨旱莲原名鳢肠，始载于《唐本草》，是临床应用较为广泛的中药材[1]，具有凉血，止血，补肾，益阴的功效。临床中医用其治疗吐血、咳血、衄血、尿血、便血、血痢、须白、白喉、淋浊、带下、阴部湿痒等临床疾病[2]。现代药理实验结果表明[3，4]，墨旱莲有效部位具有多种药理活性，如止血、保肝、抗炎和抗肿瘤、免疫调节、抗心血管疾病、抗自由基和染色体损伤、激活络氨酸酶、降血糖、抗骨质舒松等。由于中药材受到产地、采收时机、储存条件等诸多因素对质量的影响，对其质量进行评价，为规范生产、储存、使用过程提供数据，保证药材质量，确保药材的上述疗效具有重要的价值[5]。目前中药材的研发应用主要以药材有效部位为主，从中药材中提取的单体在临床的应用范围有限[7]。基于此，本文对墨旱莲的正丁醇提取有效部位采用高效液相色谱法（HPLC）对其主要活性成分（墨旱莲皂甙A、齐墩果酸、芹菜素、木犀草素、α-三联噻吩、(丁烯-3-炔-卜基)2，2-二联噻吩、蟛蜞菊内酯、去甲基蟛蜞菊内酯）的含量进行检测，为临床控制墨旱莲药材质量提供参考。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 试验用药材、仪器设备、对照品、试剂

1.1.1 药材、对照品药材购自成都荷花池中药材市场，经本院中药室采用中药材显微法鉴定为菊科植物墨旱莲全草。墨旱莲皂甙A（YJ-140307）、齐墩果酸（LY0506）、芹菜素（YJ-141203）、木犀草素（YJ-140502）、α-三联噻吩（YJ-141502）、(丁烯-3-炔-卜基)2，2-二联噻吩（YJ-141102）、蟛蜞菊内酯（YJ-140207）、去甲基蟛蜞菊内酯（YJ-140102）对照品均购自中国药品生物制品检定所。

1.1.2 仪器设备、试剂BUCHI旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司制造)；精密天平（上海良平TG630B）、岛津高效液相色谱仪，型号：LC10ATVP LC-10A进样器：SIL-10AP，输液泵：LC-10ATvp，检测器：SPD-10Avp(UV-VIS)。色谱柱：Inertsil ODS-2 4.6×250mm/5μm，流动相：采用梯度洗脱，A流动相组成：乙腈：水，0.5%~1%乙酸调节pH值在3.0~5.0，B流动相组成：甲醇：0.4%的磷酸溶液，试剂：甲醇，乙醇，氯仿，石油醚（沸程：30~60℃），丙酮，乙酸乙酯，正丁醇等。

1.2 方法

1.2.1 样供试品制备将经鉴定的干燥墨旱莲药材打粉过3号筛，精密称定100g置于1000ml具塞锥形瓶中，加入500ml乙醇精密称重，浸提4h后，过滤，收集滤液，重复上述浸提过程2次，合并三次滤液，再分别采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别采用旋转蒸发仪蒸发得到浸膏。分别得到石油醚有效部位浸膏、乙酸乙酯有效部位浸膏和正丁醇有效部位浸膏。精密称取正丁醇有效部位浸膏1g采用甲醇超声震荡溶解，经滤纸粗滤、0.45μm微孔滤膜精滤后，用甲醇洗脱三次，合并滤液混匀，称重补足至1000ml，得到供试品溶液。

1.2.2 对照品溶液制备分别精密称定墨旱莲皂甙A、齐墩果酸、芹菜素、木犀草素、α-三联噻吩、(丁烯-3-炔-卜基)2，2-二联噻吩、蟛蜞菊内酯、去甲基蟛蜞菊内酯对照品，按照说明书所采用的HPLC检测限度配置成适宜浓度，超声震荡溶解，混合均匀，制成混合对照品溶液。

1.2.3 流动相配制及梯度洗脱程序A流动相组成：乙腈：0.5%乙酸=100：10，B流动相组成：甲醇：0.4%的磷酸溶液=100：10。洗脱程序：梯度洗脱条件：0~5min，A流动相10%~15%，B流动相90~ 85%，5~10min，A流动相15%~18%，B流动相85~ 82%，10~15min，A流动相18~25%，B流动相82~ 75%，15~20min，A流动相25~30%，B流动相75~ 70%，20~25min，A流动相30~40%，B流动相70~ 60%，25~30min，A流动相40~95%，B流动相60~ 5%。流动相流速控制：0.5ml/min；柱温35℃；检测波长210nm。

1.2.4 待测成分标准曲线制作将混合对照品按照0.5倍、1倍、5倍、10倍、20倍、40倍、80倍的系数稀释，采用上述洗脱程序分离检测，以各组分的峰面积为中坐标，浓度为横坐标，绘制各待测成分的标准曲线。

1.2.5 待测成分的加样回收试验按照测定含量的供试品溶液浓度的80%、100%、120%含量加入对照品至供试品溶液中，检测各待测成分的加样回收率。

1.2.6 日间精密度将配制好的混合对照品溶液，按照设定的HPLC检测方法在同一日内分别按照每相隔4h的间隔进样检测，分别计算各成分6次检测结果之间的变异系数。

1.2.7 重复性试验按照1.2.1步骤分别取同一批次6份不同墨旱莲正丁醇提取物制作供试样品，并按照1.2.3、1.2.4设定的洗脱程序和标准曲线测定样品含量，计算6份供试品的浓度变异系数。

1.2.8 稳定性试验：将同一份供试品溶液分别与配制完成后的即刻、2h、4h、6h、8h、12h测定样品含量，计算6次不同时间含量检测结果的变异系数。

2 结果

2.1 标准曲线8种成分墨旱莲皂甙A、齐墩果酸、芹菜素、木犀草素、α-三联噻吩、(丁烯-3-炔-卜基) 2，2-二联噻吩、蟛蜞菊内酯、去甲基蟛蜞菊内酯的峰面积和浓度均呈线性关系，相关性系数均＞0.999，见表1。

表1 8种成分同时检测的标准曲线情况

2.2 加样回收率8种成分的加样回收率均＞98.0%，见表2。

2.3 日间精密度、稳定性、重复性8种成分的日间精密度变异系数、稳定性、重复率变异系数均＜3.0%，见表3。

表2 8种成分的加样回收率

表3 8种成分的日间精密度、稳定性、重复性变异系数（%）

3 讨论

目前，虽然随着中药现代化技术的发展，对于中药材有效成分的研究更为科学，很多临床应用较广的中药材均通过实验室的分离、纯化得到了很多单体物质，对单体物质逐一进行药理实验为临床中药材的应用提供了科学的依据[8，9]。但是，目前采用中药材分离出来的单体单独应用于临床治疗的案例相当少。绝大部分均采用有效部位进行制剂研究并加以临床应用。我们常见的中成药，少部分采用直接原生药材入药制成颗粒剂或者片剂，大部分是通过提取技术，采用不同极性的溶剂提取出性质不同的一组物质作为原料进行进一步的制剂成形制成中成药[10，11]。因此，研究中药材有效部位质量控制仍然是目前对中药材现代化研究的主要手段[12，13]。根据中药材成分复杂，检测难度大的特点，高效液相色谱分析技术目前仍然是研究中药材质量最为重要的方法。通过对样品的前期分离纯化，得到不同提取部位的供试品后，采用液相色谱的分离能力，将多种成分按照极性由弱到强的顺序进行洗脱，逐一采用光谱分析，得到相应成分的含量水平[14，15]。

中药材有效部位一般按照所用的提取溶剂分类，水、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇是中药材提取最为常用的溶剂。通过这一系列溶剂组合，可将中药材中大部分有效成分加以分离，而去掉中药材种大量的鞣质、蛋白质、糖类等临床通常认为的无效物质。提取方案是根据药材本身的部位、已有文献对有效成分的药理实验结果等进行设计[16，17]。墨旱莲是临床较常见的补益类中药材，其在滋补肝肾方面的作用较为显著。随着人们对自身身体健康的重视，近年来补益类中药得到广泛的关注。临床对墨旱莲的研究工作也较多。墨旱莲目前经分体纯化得到的单体成分超过九十种。通过现代药理实验证实，墨旱莲具有多种药理活性。体现了墨旱莲的药用价值。部分文献通过对墨旱莲不同溶剂提取的有效部位进行药理分析，获得了价值较大的药理活性。因此，对墨旱莲按照不同有效部分进行质量控制对于配合不同有效部分药理实验成为了必然。本文在分析多种文献的基础上[18，19]，对墨旱莲正丁醇提取物有效部位的活性成分进行质量分析，拟通过HPLC方法通过一次样品处理、进样、检测，对8种活性成分进行含量检测，为墨旱莲的正丁醇提取物的临床应用提供参考。

结果显示，采用梯度洗脱的方式，采用乙腈：0.5%乙酸和甲醇：0.4%的磷酸溶液两种流动相，按照流动相极性由弱变强的顺序，逐步调整，能洗脱出8种活性成分，并与210nmUV光处检测，墨旱莲正丁醇有效部位的8种活性成分，的峰面积和浓度均呈线性关系，相关性系数均＞0.999，8种成分的加样回收率均＞98.0%，8种成分的日间精密度变异系数、稳定性、重复率变异系数均＜3.0%。说明该方法同时检测墨旱莲正丁醇提取物种8种活性成分是可行的。但限于时间和实验条件的限制，其在对不同来源的墨旱莲药材的测定方面的工作尚未开展，这对于该方法的适用范围非常重要，应是该方法下一步应重点进行研究确认的工作。

综上所述，HPLC方法同时测定墨旱莲有效部位的8种活性成分具有较好的稳定性，可重复性好，回收率高。为墨旱莲有效部位活性成分的质量控制提供了量化手段，是适合墨旱莲临床主要以有效部位作为临床应用的特性，具有较高的应用价值。

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Simultaneous Determination of the Active Contents in N-butanol Effective Fraction of Herba Ecliptae by HPLC

KONG Yanling.Department of Pharmaceutics，Second Traoltional Chinese Medicine Hospital of Zhumadian City，Zhumadian Henan 463000，China.

Objective To establish an HPLC method for the simultaneous quantitation of the active contents in the n-butanol effective fraction of Herba Eclipta components would provide references for the quality control.Methods According to the clinical researches about the pharmacological screening of the active contents in n-butanol effective fraction of Herba Ecliptae，determined the main active components(including ginsenoside A，oleanolic acid，apigenin，luteolin，alpha terthienyl，(3 butene alkyne group 2，2 BU)one or two bithiophene，W.parthenolide and demethylwedelolactone).Commercially available and identified Eclipta was extracted with petroleum ether，ethyl acetate and normal butanol successively to get n-butanol effective fraction，the main active components in which were separated and detected by high performance liquid chromatography(HPLC)simultaneously.Mobile phase composition：elution procedure.Using the standard solutions of the eight components，the linearity，recovery，inter day precision，reproducibility and stability of the HPLC method for simultaneous determination of the 8 components were analyzed，and the value of the method was synthetically assessed.Results Using the above detection condition，the results showed that the relationship between peak area and concentration of eight active components，including ginsenoside A，oleanolic acid，apigenin，luteolin，alpha terthienyl，(3 butene alkyne Bu Ji)2，peak area and concentration of 2 one or two bithiophene，wedelolactone and demethylwedelolactone were linear dependence，and the correlation coefficients were all greater than 0.999.The recoveries of the eight components were all over 98%，and the variation coefficient of the precision，stability and repetition rate were all less than 3%.Conclusion The HPLC method for the simultaneous determination of the eight active components in the n-butanol effective fraction of Eclipta had well stability and repeatability and high recovery rate.We provided and validated a quantitative method for the quality control of the active ingredients in the effective fraction of Eclipta，which was suitable for clinical characteristics of applying clinical main effective contents in Eclipta and had higher application value.

∶HPLC；Herba Ecliptae；Effective part；Active components；Quality control

R284.2

A

1674-1129(2017)04-0475-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.04.006

2017-03-06；

2017-05-08)

孔燕凌，女，1970年生，本科，副主任中药师。