长链非编码RNAMIAT在肾透明细胞癌中的表达情况和预后意义

郑灶松 陈海城 谢文练*

长链非编码RNAMIAT在肾透明细胞癌中的表达情况和预后意义

郑灶松 陈海城 谢文练*

目的探讨长链非编码RNA MIAT在肾透明细胞癌中的表达情况及与患者临床指标的相关性，分析其作为肾透明细胞癌分子标记物的可能性。方法通过荧光定量PCR方法检测MIAT在40例肾透明细胞癌组织和40例癌旁正常组织中的表达情况，同时结合TCGA数据库分析MIAT表达水平与肾透明细胞癌患者临床指标和预后的关系。结果MIAT在肾透明细胞癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织，在肾癌细胞系中的表达明显高于正常肾小管上皮细胞，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。TCGA数据库资料分析表明，MIAT表达水平与肾癌患者T分期（P＜0.001）、M分期呈正相关（P＜0.05）。Kaplan⁃Meier生存分析表明，高表达MIAT的肾癌患者总体生存时间明显低于低表达MIAT的肾癌患者（Log⁃rank P＜0.05）。结论MIAT在肾透明细胞癌组织和肾癌细胞系中高表达，有可能成为肾透明细胞癌的分子标记物。

lncRNA；MIAT；肾透明细胞癌；预后

肾癌发病率在泌尿生殖系统肿瘤中居第3位，占肾恶性肿瘤的80%～90%，约17%的肾癌患者在诊断时便已发生远处转移，约30%的患者术后出现复发和转移［1⁃3］。由于肾癌发病隐匿，早期症状不明显，容易被患者和医生忽略，研究肾癌的分子标记物，对该疾病的早期诊断和预后评估具有重要作用。研究证明，长链非编码RNA在肾癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤中表达异常［4］。lncRNAs通过对靶基因或信号通路的调控，在肿瘤发生、发展中行使着重要的癌基因或抑癌基因的功能［5］。H19是第一个被发现的与肿瘤相关的lncRNA，它在胃癌、结肠癌、肝癌和乳腺癌等多种肿瘤中异常表达，参与调控肿瘤细胞增殖、凋亡等生物学过程［6，7］。MEG3是第一个被发现具有抑制肿瘤功能的lncRNA，其通过调控p53的表达，抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和促进细胞的凋亡［8］。

但大部分lncRNAs在人类肿瘤中的功能和作用机制仍未完全明了，在肾癌中的研究亦非常有限。本研究探讨lncRNA MIAT在肾透明细胞癌组织中的表达情况及与肾癌患者临床指标的相关性，希望能为肾癌早期诊断和预后提供新指标，为肾癌治疗提供新靶点。

1 临床资料

1.1 一般资料

本文收集2012～2016年于中山大学孙逸仙纪念医院泌尿外科行肾癌根治性手术，病理诊断确诊为肾透明细胞癌的40例患者的肾癌标本。术前均无进行放、化疗。所有病例均征得患者同意并签署相关同意书。本研究由中山大学孙逸仙纪念医院医学伦理委员会审查批准。

1.2 方法

1.2.1 取材手术后立即收集肾癌组织和癌旁正常组织。新鲜标本取下后立即放入液氮中，迅速转移至-80℃冰箱保存。

1.2.2 逆转录采用液氮研磨法研磨肾癌组织，Trizol法提取组织总RNA。逆转录体系为：总RNA（500/浓度）μL，RT⁃Primer Mix 2μL，DEPC水（8～500/浓度）μL。逆转录步骤为：37℃15min，85℃5 s。逆转录试剂盒购自Takara公司。

1.2.3 荧光定量PCR将逆转录形成的cDNA模板溶解10倍用于荧光定量PCR。荧光定量PCR反应体系为：cDNA模板2μL，上下游引物各0.52 μL，ddH2O 2μL，SYBR Green IMaster 5μL。荧光定量PCR反应步骤：95℃15 s，56℃15 s，72℃15 s，共40个循环。采用琼脂糖凝胶电泳及溶解曲线鉴定荧光定量PCR产物，ΔCt=目的基因Ct⁃内参基因Ct。PCR引物由上海捷瑞公司合成，并选择β⁃actin作为内参。荧光定量PCR试剂盒购自罗氏公司。MIAT上游引物为GCTCACACCTCCTAT TCCT，下游引物为CTTCACCAACTCTCCCACT。β⁃actin上游引物为AGCCTCGCCTTTGCCGATCC，下游引物为ACATGCCGGAGCCGTTGTCG。

1.2.4 TCGA数据库分析利用TCGA数据库（https：//gdc⁃portal.nci.nih.gov/）下载并处理448例肾癌和67例癌旁组织RNAseq数据。

1.3 统计学分析

使用SPSS统计软件进行统计分析。计量资料用单因素方差分析和t检验。生存分析采用Kaplan⁃Meier法及log⁃rank检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNAMIAT在肾透明细胞癌组织中明显高表达

本研究提取40对肾透明细胞癌组织和癌旁正常组织的总RNA，逆转录后进行荧光定量PCR检测。结果表明，MIAT在肾透明细胞癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织（P＜0.05，图1）。

图1 M IAT在肾透明细胞癌组织中的表达情况

2.2 lncRNAMIAT在肾癌细胞系中明显高表达

我们检测MIAT在肾癌细胞系（Caki⁃1、Caki⁃2、786⁃O、ACHN、769⁃P、A⁃498）和正常肾小管上皮细胞HK⁃2中的表达情况，结果表明，MIAT在肾癌细胞系中的表达明显高于正常肾小管上皮细胞（P＜0.05，图2）。

2.3 lncRNAMIAT表达水平与肾癌患者预后的相关性

我们进一步在TCGA数据库中验证MIAT在肾癌组织中的表达情况，结果表明，MIAT在肾透明细胞癌组织中的表达明显高于正常组织。我们统计分析MIAT表达水平与肾癌患者临床指标的关系，发现MIAT表达水平与患者T分期（P＜0.001）、M分期呈正相关（P=0.03）（表1）。我们通过Kaplan⁃Meier法分析MIAT表达水平与肾癌患者总体生存时间的关系，结果表明，高表达MIAT的肾癌患者总体生存时间明显低于低表达MIAT的肾癌患者（Log⁃rank P＜0.05）。

图2 M IAT在肾癌细胞系和肾小管上皮细胞中的表达水平

表1 M IAT表达水平与肾癌患者临床指标的相关性

图3 TCGA数据库分析M IAT在肾癌组织中的表达水平及预后关系A MIAT在肾癌组织和正常肾组织中的表达情况；BKaplan⁃Meier分析MIAT表达水平与肾癌患者预后的关系

3 讨论

研究表明，长链非编码RNA在多种肿瘤中异常表达，参与调控肿瘤发生发展过程，是肿瘤潜在的肿瘤标记物和治疗靶点。HOTAIR在乳腺癌、胃癌、食管癌、肝癌中高表达，通过与PCR2的相关作用促进H3K27甲基化，进而促进肿瘤细胞增殖和侵袭［9］。PVT⁃1在结直肠癌中该表达，通过TGF⁃β信号通路调控结直肠癌细胞浸润与转移［10］。目前泌尿系统长链非编码RNA的研究主要集中在膀胱癌和前列腺癌，而在肾癌发生、发展中的作用及其机制研究相对较少。

MIAT是位于22号染色体长臂的长链非编码RNA。近年来的研究表明，MIAT在多种疾病进程中发挥重要作用。Zhou等人研究发现，MIAT通过影响Nrf2表达，调控高糖介导的肾小管上皮损伤［11］。Shen等人研究发现，沉默MIAT表达能抑制TNF⁃α诱导的人晶状体上皮细胞增殖、迁移。机制研究也表明MIAT通过内源竞争性RNA的形式，并与AKT和miR⁃150⁃5p形成环路，从而调控人晶状体上皮细胞［12］。目前尚未见MIAT在肾癌组织中表达水平和临床意义的研究。因此，本研究收集手术切除的肾癌组织和癌旁正常组织，通过荧光定量PCR检测MIAT的表达情况。结果表明，MIAT在肾透明细胞癌组织中表达明显高于癌旁正常组织，差异具有统计学意义。进一步利用TCGA数据库的临床资料，通过Kaplan⁃Meier分析发现，高表达MIAT的肾癌患者总体生存时间明显低于低表达MIAT的肾癌患者。因此，可以认为MIAT对判断肾癌患者预后具有一定的临床意义。

综上所述，我们的研究表明肾透明细胞癌组织中MIAT的表达明显高于癌旁正常组织。高表达MIAT的肾癌患者总体生存时间明显低于低表达MIAT的肾癌患者。因此，MIAT有望成为肾癌早期诊断和评估预后的标记物。

参考文献

［1］Rini BI，Campbell SC，Escudier B.Renal cell carcinoma［J］. Lancet，2009，373（9669）：1119-1132.

［2］Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics，2016［J］. CACancer JClin，2016，66（1）：7-30.

［3］Capitanio U，Montorsi F.Renal cancer［J］.Lancet，2016，387（10021）：894-906.

［4］Huarte M.The emerging role of lncRNAs in cancer［J］.Nat Med，2015，21（11）：1253-1261.

［5］Seles M，Hutterer GC，Kiesslich T，etal.Current Insights into Long Non⁃Coding RNAs in Renal Cell Carcinoma［J］.Int JMol Sci，2016，17（4）：573.

［6］Raveh E，Matouk IJ，Gilon M，Hochberg A.The H19 Long non⁃coding RNA in cancer initiation，progression and metastasis⁃a proposed unifying theory［J］.MolCancer，2015，14：184.

［7］Yang F，Bi J，Xue X，etal.Up⁃regulated long non⁃coding RNA H19 contributes to proliferation of gastric cancer cells［J］. FEBSJ，2012，279（17）：3159-3165.

［8］Zhou Y，Zhang X，Klibanski A.MEG3 noncoding RNA：a tumor suppressor［J］.JMol Endocrinol，2012，48（3）：R45-53.

［9］Rinn JL，KerteszM，Wang JK，etal.Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs［J］.Cell，2007，129（7）：1311-1323.

［10］Takahashi Y，Sawada G，Kurashige J，et al.Amplification of PVT⁃1 is involved in poor prognosis via apoptosis inhibition in colorectalcancers［J］.Br JCancer，2014，110（1）：164-171.

［11］Zhou L，Xu DY，Sha WG，et al.Long non⁃coding MIAT mediates high glucose⁃induced renal tubular epithelial injury［J］.Biochem BiophysRes Commun，2015，468（4）：726-732.

［12］Shen Y，Dong LF，Zhou RM，et al.Role of long non⁃coding RNA MIAT in proliferation，apoptosis and migration of lens epithelial cells：a clinical and in vitro study［J］.J Cell Mol Med，2016，20（3）：537-348.

The expression and prognostic significance of lncRNA M IAT in clear cell renal cell carcinoma

ZHENG Zaosong，CHEN Haicheng，XIE Wenlian.
Department of Urology，Sun Yat⁃sen Memorial Hospital，Sun Yat⁃sen University，Guangzhou，510289.Corresponding author：XIEWenlian，wenlianxie@ 126.com

Objective To explore the expression and prognostic significance of lncRNA MIAT in clear cell renal cell carcinoma，and evaluate its possibility to be a biomarker of clear cell renal cell carcinoma.Methods The expression ofMIAT in clear cell renal cell carcinoma and normal tissueswere detected by qRT⁃PCR.The clinical significance and prognostic value of MIAT in clear cell renal cell carcinoma was analyzed using TCGA data.Results The expression of MIAT in clear cell renal cell carcinoma tissueswas significantly higher than in normal tissues.The expression ofMIAT in renal cancer cellswas significantly higher than in HK⁃2.The expression ofMIATwas positively associated with T stage（P＜0.001）and M stage（P=0.03）.Meanwhile，patients with higher MIAT expression had a shorter survival time than patientswith lower MIAT expression.Conclusion LncRNA MIATwas overexpressed in clear cell renal cell carcinoma tissues and renal cancer cells，and might be a biomarker for clear cell renal cellcarcinoma.

lncRNA；MIAT；clear cell renal cell carcinoma；prognosis

R737.11

A

10.3969/j.issn.1009⁃976X.2017.04.003

2017-06-25）

国自然科学基金（81672534）

510289广州中山大学孙逸仙纪念医院泌尿外科

*通讯作者：谢文练，Email：wenlianxie@126.com