G0S2基因在胶质瘤中的表达及生物学意义

谢 琳 李凯舒，2 刘安民*

·论著与临床研究·

G0S2基因在胶质瘤中的表达及生物学意义

谢 琳1李凯舒1，2刘安民1*

目的分析G0S2（G0S2G0/G1 switch 2）基因与胶质瘤预后及恶性程度的相关性。方法应用生物信息学技术对GSE33331芯片进行分析得出差异性表达的基因G0S2，并使用DAVID、TCGA数据库（The Cancer Genome Atlas）对该基因进行GO（Gene Ontology）分析及生存分析，使用实时荧光定量PCR方法研究G0S2与胶质瘤级别的相关性。结果生物信息学分析结果提示G0S2是芯片中表达差异第3显著的基因（logFC=-2.53672，P＜0.001），该基因参与肿瘤的脂质、分子等代谢过程，高表达该基因的胶质瘤患者生存时间显著下降（Chisq=150，P＜0.001）。此外通过40例胶质瘤的qPCR结果证实G0S2在高级别与低级别胶质瘤中差异表达（t=3.168，P= 0.003）。结论G0S2基因表达水平与胶质瘤恶性程度及预后相关。

G0S2基因；胶质瘤；恶性程度；预后

脑胶质瘤是成年人中最常见的颅内原发肿瘤，而胶质瘤具有呈浸润性生长的特点，通过外科手术往往难以完全切除，因此高级别胶质瘤术后需辅以放疗及同步化疗治疗，但患者的预后仍然欠佳［1，2］。因此，寻找新的胶质瘤治疗靶点或预后判断指标成为胶质瘤治疗的重要研究方向。G0/G1开关基因2（G0S2）被认为是在凝集素激活的人类淋巴细胞中被早期激活基因所表达的一种重要的基础蛋白质，并且被认为能调控细胞G0期至G1期的转换，从而调控细胞增殖［3］。此外，尚有研究报道GOS2能够通过与脂肪细胞中甘油三酯脂肪酶直接作用而抑制脂肪的分解代谢等［3，4］。近年来有文献报道在膀胱癌、慢性髓细胞白血病、肺癌细胞中G0S2基因可抑制细胞增殖或增加细胞对化疗药物的敏感性［5⁃7］。但是通过对胶质母细胞瘤基因芯片GSE33331［8］的数据分析却得到了与上述肿瘤中不同的结论。综合相关的结果则提示G0S2基因的功能可能具有组织间的差异性，在不同的肿瘤组织中能发挥不同的生物学功能。因此本研究旨在探讨G0S2基因在胶质瘤中的表达水平与患者预后的关系，并希望其能作为反映胶质瘤诊断及治疗的新生物学指标，成为胶质瘤治疗和研究的新靶点。

1 材料与方法

1.1 基因芯片数据提取

GEO数据库下载GSE33331基因芯片数据［8］。该基因芯片中的26例患者均为胶质母细胞瘤，而且已知其相关的临床结局。本研究将生存期小于18个月（1年半）的17名患者纳入为短期生存组；9名生存期超过18个月的患者纳入为长期生存组。将短期生存组以及长期生存组进行对比，选取前250个差异性表达的基因制作热图，并进一步通过DAVID数据库［9］对具有差异性表达的基因进行GO（Gene ontology）分析，同时利用TCGA数据库（http：//cancergenome.nih.gov/）下载胶质瘤患者病例资料（共计1107例胶质瘤患者生存时间数据，以及相应mRNA表达数据），进行生存差异分析。

1.2 研究对象

收集2015年1月至2017年1月在本院接受手术治疗的胶质瘤患者的病例资料以及病理标本。入选标准：①病理确诊为WHOⅠ～Ⅳ的胶质瘤患者；②病理资料完整者。排除标准：①术前进行了放化疗或免疫治疗；②术后未经规范化治疗患者；③临床资料不完整。根据符合入选标准及排除标准排除26例，最终符合入选标准病例共40例。入选病例中，男性患者23例，女性患者17例，患者平均年龄44.5±14.3岁，肿瘤均位于幕上，相关资料详见表2。将Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤分为低级别胶质瘤组，将Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤分为高级别胶质瘤组。

1.3 qPCR方法

Trizol法提取胶质瘤标本中的总RNA并利用NanoDrop对提取液进行定量；利用Takara逆转录试剂盒对RNA进行逆转录并获取cDNA样品。相关反应条件为：预变性95℃3 min，90℃30 s，56℃10 s，共40个循环并得到逆转录产物cDNA以进行qPCR检测。选用GAPDH作为实验内参，相关引物序列：GAPDH正向引物：5′⁃GCACCGTCAAGGCTGAGAAC⁃3′，反向引物：5′⁃TGGTGAAGACGCCAGTGGA⁃3′，扩增长度267 bp；G0S2正向引物：5′⁃CCTGGCCAAGGAGATGATG⁃3′，反向引物：5′⁃CTGCACACAGTCTCCATCAGG⁃3′，扩增长度117bp。参照GAPDH表达结果计算得到G0S2的CT值。

1.4 统计学分析

相关数据使用Excel归纳处理，低级别以及高级别胶质瘤组间G0S2基因表达差异使用卡方检验以及t检验进行分析。R软件Limma包对芯片进行数据分析，survival包对TCGA数据进行生存分析。以P＜0.05为差异有统计学意义判断指标。

2 结果

2.1 对GSE33331基因芯片数据进行分析

将生存期小于18个月（1年半）的17名患者纳入为短期生存组；9名生存期超过18个月的患者纳入为长期生存组。对芯片进行质量控制并绘制箱形图，结果提示样本均一度良好，可进行差异分析（图1 A）。绘制火山图比较两组病例中差异基因的分布情况（图1 B）。取前250例差异性表达基因绘制热图，在短时间生存组中表达升高的96个基因考虑为危险性因子，另外154个表达下降的基因则考虑为保护性因子（图1A）。其中在短期生存组中升高最明显的前3位基因为SOX11（204914_s_at，logFC=2.79268，P=0.021401）、KNL1（228323_at，logFC=2.55922，P=0.002262）、G0S2（211564_s_at，logFC=2.53672，P＜0.001）。

2.2 GO分析了解两组样本间生物学特性的改变情况

通过DAVID数据库对前250个差异性表达的基因进行GO分析，取基因富集数大于20的GO通路绘制GO分析图，结果提示在两组胶质瘤样本中，细胞内物质合成、DNA转录等多个GO通路具有显著差异（图2）。对基因富集度最高的前5位GO通路进行列表，详见表1。

2.3 G0S2基因与胶质瘤患者预后具有相关性

使用TCGA数据库对在短期生存组中升高最明显的前3位基因SOX11、KNL1、G0S2进行生存分析，SOX11、KNL1基因在胶质瘤中的表达差异与生存时间无显著相关性（两者P＞0.05）。G0S2不但在GSE33331芯片短期生存组中表达升高（图3A），而且在TCGA数据库中，该基因在胶质瘤中表达量的升高与不良预后相关（Chisq=150，P＜0.001），详见图3 B。

图1 GSE33331芯片差异基因生物信息学分析结果。

2.4 PCR检测G0S2基因在胶质瘤样组织本中的表达

通过对本院40例胶质瘤患者（详细资料见表2）的肿瘤样品进行检测，G0S2基因在不同级别的胶质瘤组织中的表达具有差异性（t=3.168，P=0.03），在高级别胶质瘤组中表达升高，G0S2基因的表达水平可反映胶质瘤恶性程度，详见图4。

3 讨论

恶性胶质瘤病死率极高，其术后5年死亡率在全身肿瘤中排第3位，仅次于胰腺癌和肺癌。目前胶质瘤的治疗方案主要包括：手术切除，术后放疗以及替莫唑胺同步化疗，并辅以生物靶向治疗，但患者中位生存期仅为1.5年［1，2］。因此，找到并研究与胶质瘤恶性程度以及预后相关的因子，对推动胶质瘤的治疗具有重要意义。

本研究通过对GEO数据库的检索，获得了胶质母细胞瘤基因芯片GSE33331，该芯片含有26例胶质母细胞瘤基因样本，其中包括17例生存时间低于18个月（1.5年）的短时间生存患者，以及9例生存时间长于18个月的长时间生存患者。本研究利用生物信息学技术，通过对两组患者的基因表达数据进行分析，得到了多个与胶质瘤预后有关的基因，而差异性最大的前250个基因则是最有可能对胶质瘤患者预后产生不良影响的重要因素。而通过对这250基因的生物学功能进行的GO分析，提示两组胶质瘤样本中在分子合成、基因表达等方面存在着显著的差异。而在这250个差异性表达基因中，G0S2是短时间生存组中差异性表达最高的第3位基因，尽管SOX11、KNL1基因的表达差异（logFC分别为-2.79268017、-2.559219494）要高于G0S2（logFC=-2.536722985），但TCGA生存数据分析表明仅G0S2基因表达与胶质瘤患者预后具有相关性。因此，通过对胶质母细胞瘤基因芯片GSE33331以及TCGA数据库的数据分析，我们发现了一个与胶质瘤患者预后具有相关性的基因G0S2。G0S2基因最初是从凝集素激活的人类淋巴细胞中被鉴定出来的基因，该基因所编码的蛋白是淋巴细胞激活早期所表达的基础蛋白质之一，并且被认为能调控细胞G0期至G1期的转换，从而调控细胞增殖，因此被称之为G0/G1开关基因2［3］。此外，GOS2能够通过与脂肪细胞中甘油三酯脂肪酶直接作用而参与了细胞内脂质的合成与代谢［3，4］。针对GOS2的研究主要集中在脂质代谢方面，而与肿瘤相关的研究并不多，近年来有部分研究指出，G0S2基因可作为一种保护因子，与膀胱癌、慢性髓细胞白血病、肺癌细胞的增殖抑制以及化疗敏感等机制相关［10］。而上述报道的结论与本研究的结果存在着一定的差异，本研究则首次报道了G0S2基因表达与胶质瘤不良预后相关。而造成这种差异的原因，我们推测可能与G0S2基因功能的组织差异性有关。在不同的肿瘤组织中各种基因的表达具有一定的差异性而且肿瘤内部的微环境也不相同，因此G0S2基因可能在不同的组织环境中发挥着不同甚至可能相反的作用。因此，对G0S2基因功能做进一步深入的研究可能对胶质瘤以及其他类型肿瘤的诊断及治疗起到一定的积极意义。此外，我们进一步在胶质瘤组织标本水平上对G0S2基因的生物学意义进行了初步的验证。通过对我院40例胶质瘤组织标本的qPCR检测，提示了G0S2基因在不同级别胶质瘤中的表达具有差异性，因此对该基因表达水平的测定有助于对胶质瘤恶性程度进行判断。然而目前暂时没有G0S2基因在胶质瘤生物学作用机制的相关研究见于报道，而我们将在后续的研究中对该基因与胶质瘤预后相关的生物学机制展开更为深入的研究。

图2 差异基因GO分析结果

表1 差异性表达基因GO功能注释

综上所述，G0S2基因是影响胶质瘤患者预后的重要因子，通过对胶质瘤组织中G0S2基因的检测能判断胶质瘤的恶性程度，并对患者预后做出预测。因此，G0S2基因有望作为反映胶质瘤诊断及治疗的新生物学指标，并为改善胶质瘤患者预后提供帮助。

图3 G0S2基因与胶质瘤患者预后相关

表2 40例胶质瘤患者基本资料(n)

图4 G0S2基因在不同级别胶质瘤中差异表达

［1］Stupp R，Mason WP，van den BentM，et al.Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma［J］.N Engl JMed，2005，352（10）：987⁃996.

［2］Mirimanoff RO，Gorlia T，Mason W，et al.Radiotherapy and temozolomide for newly diagnosed glioblastoma：recursive partitioning analysis of the EORTC 26981/22981⁃NCIC CE3 phase III randomized trial［J］.JClin Oncol，2006，24（16）：2563⁃2569.

［3］Yamada T，Park CS，Shen Y，et al.G0S2 inhibits theproliferation of K562 cells by interacting with nucleolin in the cytosol［J］.Leuk Res，2014，38（2）：210⁃217.

［4］Heier C，Zimmermann R.The sparing use of fat：G0s2 controls lipolysis and fatty acid oxidation［J］.Diabetologia，2015，58（1）：7-9.

［5］Chen X，Gu P，Xie R，et al.Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K is associated with poor prognosis and regulates proliferation and apoptosis in bladder cancer［J］.J CellMolMed，2017，21（7）：1266-1279.

［6］Ryynanen J，Seuter S，Campbell MJ，et al.Gene regulatory scenarios of primary 1，25⁃dihydroxyvitamin d3 targetgenes in a humanmyeloid leukemia cell line［J］.Cancers（Basel），2013，5（4）：1221-1241.

［7］Kusakabe M，Watanabe K，Emoto N，et al.Impact of DNA demethylation of the G0S2 gene on the transcription of G0S2 in squamous lung cancer cell lineswith orwithoutnuclear receptor agonists［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，390（4）：1283-1287.

［8］Donson AM，Birks DK，Schittone SA，et al.Increased immune gene expression and immune cell infiltration in high⁃grade astrocytoma distinguish long⁃term from short⁃term survivors［J］. JImmunol，2012，189（4）：1920-1927.

［9］Huang DW，Sherman BT，Lempicki RA.Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources［J］.NatProtoc，2009，4（1）：44-57.

［10］ZaganiR，El⁃Assaad W，Gamache I，etal.Inhibition ofadipose triglyceride lipase（ATGL）by the putative tumor suppressor G0S2 or a small molecule inhibitor attenuates the growth of cancer cells［J］.Oncotarget，2015，6（29）：28282-28295.

Expression of G 0S2 gene in glioma and its biological significance

XIE Lin1，LI Kaishu1，2，LIU Anmin1.
1DepartmentofNeurosurgery，Sun Yat⁃sen Memorial Hospital，Sun Yat⁃sen University，Guangzhou 510120，China.2Department of Neurosurgery，the Sixth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Qingyuan 511500，China.Corresponding author：LIUAnmin，linxie40@163.com

Objective To analyze the correlation between G0S2（G0S2G0/G1 switch 2）gene and glioma prognosis and malignancy.M ethods The GSE33331 chip was analyzed by bioinformatics technique and the differential expression gene G0S2 was obtained.GO（Gene Ontology）analysis and survival analysis of G0S2 gene were performed using DAVID and TCGA database（The Cancer Genome Atlas）.The correlation between G0S2 and glioma levelwas studied by real⁃time fluorescence quantitative PCR.Results Bioinformatics analysis showed that G0S2 was the thirdmost significant gene in the chip（logFC=⁃2.53672，P＜0.001）.The genewas involved in themetabolism of lipids andmolecules，and the survival time ofglioma patientswith high expression of this genewas significantly decreased（Chisq=150，P＜0.001）.In addition，40 cases of glioma with qPCR results confirmed that G0S2 was differentially expressed in high and low grade gliomas（t=3.168，P=0.003）.Conclusion The expression level of G0S2 gene is related to the degreeofmalignancy and prognosisofglioma.

G0S2；glioma；malignantdegree；prognosis

中图分类号：R739.41文献标识码：A

10.3969/j.issn.1009⁃976X.2017.04.001

2017⁃06⁃06）

广东省科技发展专项基金（2016A020215061）

1510120广州中山大学孙逸仙纪念医院神经外科；2511515广东清远广州医科大学附属第六医院神经外科

*通讯作者：刘安民，Email：linxie40@163.com