新一代抗结核分枝杆菌疫苗将会建立在现用卡介苗的基础上吗？

赵爱华，徐苗，王国治

中国食品药品检定研究院结核病疫苗室，北京 100050

·特约专稿·

新一代抗结核分枝杆菌疫苗将会建立在现用卡介苗的基础上吗？

赵爱华，徐苗，王国治

中国食品药品检定研究院结核病疫苗室，北京 100050

本文针对以卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)为基础的结核分枝杆菌新疫苗本身的缺陷问题、临床前药效学评价面临的问题、临床研究可能面临的有效性评价问题及伦理问题等，对“新一代抗结核分枝杆菌疫苗将会建立在现用BCG的基础上”的观点进行评述。认为以BCG为基础的新疫苗保护力可能超过现用BCG，但要显著提高其对成人的保护效果尚有难度；新疫苗用于新生儿的临床研究因存在伦理问题而可能无法开展；针对潜伏结核感染人群的免疫预防是控制结核病的重要手段，以现用BCG为基础的新疫苗可能无法应用于此类人群。因此，新一代主流抗结核分枝杆菌疫苗将不会是建立在现用BCG基础之上的疫苗。

结核病；疫苗；卡介苗

结核病是影响我国人民健康的重要传染病，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)估计我国每年新发肺结核93万例，占全球10%。2015年，全国报告肺结核患者在所有甲乙类传染病中仅次于病毒性肝炎，居第2位。卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)为目前世界上唯一可用于预防结核病的疫苗，每年约1.2亿婴儿接种BCG，但其对成人肺结核的保护效果不理想，在免疫抑制人群中易引起播散性结核病。因此，BCG替代品及更有效的新型抗结核分枝杆菌疫苗迄待研究。近期Zhang等在MolecularTherapy上发表了一篇文章“VariableVirulenceandEfficacyofBCGVaccineStrainsinMiceandCorrelationWithGenomePolymorphisms”，对全球广泛使用的13株BCG进行了安全性和保护效果的横向比较，结果发现BCG菌株的不同直接影响疫苗的效果[1]。该文引起国内外研究者的关注，有学者认为“该成果对目前的BCG接种计划有重要意义，尤其对正在和未来进行的新型抗结核分枝杆菌疫苗的研究在思路上有指导意义”[2]，并认为“新一代抗结核分枝杆菌疫苗将会建立在现用BCG的基础上”[3]。然而，由于结核分枝杆菌感染者和结核病患者类型的复杂性，预防结核分枝杆菌感染的初免疫苗、初免加强疫苗及预防结核病发病的治疗性疫苗等的研发面临巨大挑战。本文为此提出对新型抗结核分枝杆菌疫苗的思考和分析。

纵观数十年来几代结核分枝杆菌疫苗的研发历程，不少学者已从早期试图研制一种结核分枝杆菌新疫苗替代BCG的思路，衍变为试图通过弥补BCG有效抗原丢失、保护效期短和对已感染人群无效的缺陷来研究不同类型的疫苗。此外，成人中既有未接种BCG者又有BCG接种后阴转者或维持阳性者，还有为数不少的潜伏结核感染者。因此，对免疫与感染背景不同的人群采用不同类型的疫苗实施精准免疫，将成为我国结核病免疫预防的基本策略。结核分枝杆菌新疫苗不可能是单一品种的疫苗，所谓建立在现用BCG基础上的新一代抗结核分枝杆菌疫苗将不可能成为预防结核病的主流疫苗，理由如下。

1 BCG或以BCG为基础的新疫苗无法预防潜伏结核感染

1.1 BCG无法对潜伏结核感染者实施有效预防

疫苗接种是控制传染病的一个重要手段，结核病也不例外。目前，预防结核病唯一可用的BCG对婴幼儿和青少年血行播散性结核病(如结核性脑膜炎、粟粒型结核病等)具有较好的预防效果，但对阻止成人肺结核的传播效果甚微。

印度南部开展的保护力研究结果显示，BCG接种7.5年后，肺结核发病例数疫苗组高于安慰剂组，低、高剂量疫苗组分别为65与58例，安慰剂组为47例；接种15年后，3组肺结核年平均发病率基本相同，分别为54/10万、55/10万、56/10万。结果提示，BCG对肺结核不能提供保护作用。该研究中临床人群感染背景是： 以3 IU结核菌素纯蛋白衍生物国际标准品(purified protein derivative-stardand，PPD-S)皮试反应≥12 mm为结核分枝杆菌感染阳性标准，15岁以上人群中，男性阳性率高达62%～86%，女性为48.5%～72.3%；非结核分枝杆菌感染率异常高(1～4岁组为34%，5～9岁组为67%，10～19岁组为92%)，成人中非结核分枝杆菌感染率也在90%以上[4-6]。结果证明，BCG对结核分枝杆菌或非结核分枝杆菌感染人群无效。因此，以BCG为基础的新疫苗无法对潜伏结核感染者实施有效预防。

1.2 潜伏结核感染者是结核病的主要来源之一

结核分枝杆菌疫苗研究的难点是其接种对象的免疫与感染背景有差异。我国大多数人接种过BCG，随着时间推移，部分人群仍维持对BCG反应阳性，部分人群转阴，部分人群感染了结核分枝杆菌。在免疫与感染背景各异的3类人群中，BCG对接种后转阴人群可能有效，对已感染者无效。最近，WHO提出2016—2035年全球结核病新战略，其目标是至2035年将这些国家每年每百万人的结核病新发病例数降至10例以下，下一步目标是至2050年全面消除结核病，每年每百万人口少于1例。WHO这一新框架突出强调了8种重要干预措施，其中最重要的是“对活动性结核病患者和高危人群中的潜伏结核感染者实施筛查并给予适当治疗”。潜伏结核感染高危人群包括结核病高发地区潜伏感染者、结核病患者密切接触者、老年人、大中学生、监狱服刑人员、医护工作者等；与结核病有关联的其他疾病如糖尿病、风湿病、艾滋病、免疫抑制治疗、透析患者中的潜伏结核感染者。此外，根据第4次全国结核病流行病学抽样调查报告，我国总人口中44.5%为结核分枝杆菌感染者[7]，其中5%～10%的人一生中迟早会发生临床疾病[8]，这部分人如果得不到保护，新的结核病患者将不断出现，难以有效控制。

因此，结核病免疫预防控制的重点人群将是以BCG为基础的新疫苗无法预防的潜伏结核感染者。

2 以BCG为基础的新疫苗临床研究可能面临的难题

BCG本身的缺陷或其依然保留的免疫力可能影响以BCG为基础的新一代疫苗的临床评价结果。

2.1 以BCG为基础的新疫苗用于新生儿免疫可能面临的难题

目前，多数研究者认为BCG的主要缺陷是：在长期传代过程中丢失部分有效抗原、接种后保护期短及对已感染结核分枝杆菌的人群无效。在这三大缺陷中，同一时间接种以BCG为基础的新疫苗与临床研究对照BCG，无法明显提高BCG远期保护效果。新生儿结核分枝杆菌感染率极低，且以BCG为基础的新疫苗对潜伏感染者无效，唯一可能提高其保护效果的方式是通过重组增加有效抗原加以弥补。然而，多数临床研究结果已证实BCG对婴幼儿有良好的保护效果，要提高并验证其能提高保护效果，需庞大的临床研究受试者。根据我国计划免疫接种程序，新生儿于出生后24 h接种BCG，如果要在新生儿中进行以BCG为基础的新疫苗临床评价，就必须在新生儿出生前与家长签订知情同意书。在目前多数以成人作为志愿者的疫苗临床研究尚难推广的情况下，让家长同意未出生新生儿作为志愿者的可能性极低，这也就意味着在中国大规模开展以BCG为基础的新疫苗对新生儿保护效果的临床研究的可能性微乎其微。

此外，在新生儿中开展临床试验的研究者必须承担极大的可能产生偶合反应的风险。根据文献报道，我国婴儿实际死亡率为1.8%～1.9%[9]，提示以新生儿为临床受试者将不可避免地会面临由于其他疾病或新生儿自身原因导致死亡的偶合事件。非洲冈比亚进行了一项新生儿BCG接种后MVA85A疫苗加强免疫的临床研究，在4 754名接种BCG的新生儿候选者中，接种后3个月内有25名死亡。接种MVA85A疫苗或安慰剂后，MVA85A疫苗组1 399名受试者和安慰剂组1 398名受试者中又分别有7名与4名死亡[10]。在不足5 000人的临床研究中有36名新生儿或婴儿死亡，尽管死亡原因与疫苗接种并无直接关联，但高偶合死亡发生率不可避免地会干扰临床研究的正常进行。可以设想，如果同样的偶合死亡事件发生在以独生子女为主的中国，将会引起多大的混乱。数年前已上市的乙型肝炎疫苗接种导致1名新生儿偶合死亡即产生了极大的社会反响[11]，未上市样品的临床研究只要出现个别受试者死亡都将对研究者和政府形成强大的社会舆论压力，而这种潜在的压力将严重制约涉及新生儿疫苗临床研究的开展，可能成为疫苗研究者放弃此类疫苗在中国开展新生儿临床研究的主要因素。

因此，鉴于BCG对婴儿具有良好的保护效果及临床伦理因素，难以开展以BCG为基础的新疫苗的新生儿临床研究。

2.2 以BCG为基础的新疫苗与对照BCG成人免疫研究可能面临的难题

目前，国内多数以BCG为基础的新疫苗研究立论依据是BCG对成人保护效果欠佳或无效。WHO于1995年发表的BCG声明指出[12]：“目前并无可靠的证据表明反复接种BCG可预防结核病。对已接种过BCG者不提倡复种，因为没有任何科学证据支持这一做法，对任何人都无须进行多次复种。”然而，随着20世纪末大量结核病病例的出现，人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染和艾滋病疫情蔓延及分枝杆菌耐药性的产生，WHO于2004年发布了关于BCG的立场文件[8]，明确BCG不能防止结核分枝杆菌原发感染及潜伏结核感染的复燃，认为其保护效力差异大的原因可能与既往暴露于环境分枝杆菌的程度不同有关。这些观点与近年来BCG效力研究的观点类似，但尚有差距。迄今为止，收集数据最多的系统回顾与meta分析认为，BCG对结核病的保护效果存在变异，主要原因是临床研究没有剔除已被分枝杆菌致敏者及研究现场靠近赤道，这两个因素可解释大部分BCG无效的原因[13]。另一项针对暴露于肺结核患者的16岁以下儿童感染与发病分析认为，BCG不但能预防感染，还能预防感染至发病的进程[14]。WHO于2004年发表的BCG立场文件中，对其复种的观点发生了变化。通过比较WHO 2004年立场文件内容与1995年声明内容，可见WHO基本否定了1995年声明中的相关建议，肯定了PPD阴性为BCG接种指征，BCG对结核菌素试验阳性人群无效，接种后结核菌素试验呈阴性可复种[15]。

应注意的是，如果BCG对结核菌素试验阴性人群有效，这对以BCG为基础的新疫苗研究是一个极大挑战。如果只单纯进行成人BCG接种保护效果的评价研究，只要BCG接种组的保护效力超过安慰剂组即可；而如果要进行以BCG为基础的新疫苗临床保护力评价，新疫苗保护效果除优于安慰剂组外，还需超过BCG对照组。虽然不排除重组BCG的效果可能优于BCG，但在BCG依然有效的基础上体现新疫苗保护力强于现用疫苗，就必须扩大临床研究志愿者的数量与观察时间，这将大大提高临床研究的成本与难度，也不排除会出现与非洲冈比亚BCG接种后类似的结果，即加强免疫人群的保护率略高于单纯BCG对照组，但无统计学差异。

因此，鉴于不能排除现用BCG对结核菌素试验阴性成人依然具有保护效果，以BCG为基础的新疫苗用于成人临床研究要获得具有统计学意义的结果难度较大。

3 以BCG为基础的新疫苗临床前药效学研究面临的难题

3.1 以BCG为基础的新疫苗菌株选择的困惑

众所周知，BCG在长期传代过程中形成了生物学特性与保护力各异的亚株，但选取哪一种菌株作为母体来构建以BCG为基础的新疫苗是结核研究领域迄今尚未解决的重大问题，菌株的选择直接影响新一代结核分枝杆菌疫苗的临床使用效果和范围。

目前，BCG菌株选择有以下难点：①尽管BCG已有百年应用历史，但迄今缺少系统的不同BCG菌株对人体保护力的比较研究。②在无人体使用效果相关数据的情况下，动物保护力成为主要评价标准，但不同研究者采用不同的动物模型，即使相同的模型，也由于免疫剂量与周期、感染毒株毒力与攻击量及评价指标的不同而结论不同[1,16]。③即使确定了不同BCG亚株的保护力，仍面临选择的难题。选择保护力强的BCG亚株，可能增加重组新疫苗的保护效果超过宿主菌的难度；选择保护力弱的BCG亚株，尽管可能重组新疫苗的保护效果超过原始菌，但临床上可能无法超过保护力强但未经任何改造的BCG菌株。④目前研究用菌株多数不来自生产用的主种子批，由于不同菌株的来源不同，背景不清晰，难以溯源，不同实验室得出的结果并不能代表实际用于生产的该菌株的效果。

因此，鉴于目前缺少不同菌株人体保护力与系统规范动物保护力的相关数据，选择适宜BCG宿主菌为基础开展新疫苗研究仍是难点。

3.2 我国生产用BCG菌株的优良保护力增加了以BCG为基础的新疫苗研究难度

未来在中国进行的以BCG为基础的新疫苗研究，将不可避免地于临床前和临床研究中采用我国现用BCG菌株为对照，理论上新疫苗的保护力应超过现用疫苗，或保护力达到现用疫苗而安全性优于现生产用菌株(BCG D2PB302)。20世纪80年代初，我国曾以豚鼠为动物模型，皮内免疫接种BCG，剂量为100 CFU/0.1 mL(约为人用剂量的1/100)。结核分枝杆菌攻击途径采用气溶胶感染与皮下注射两种方式，以脏器病变指数与脏器结核分枝杆菌分离数的对数值为指标，评价该BCG菌株的保护效果。与对照组相比，BCG D2PB302株气溶胶感染模型差值为3.56(安慰剂组脾菌分离数的对数值为5.84±1.51，BCG Shanghai为2.28±2.19)，皮下攻击模型差值为3.28(安慰剂组脾菌分离数的对数值为4.82±0.68，BCG D2PB302为1.54±1.62)[17]。

采用皮下注射攻击途径感染动物，以人用剂量1/10的BCG D2PB302进行近期与远期保护力的研究。结果显示，近期BCG D2PB302菌株组与对照组的脾菌与病变指数差值为4.73～5.74，窗口大， BCG组脾菌分离数对数值的平均值为0.38～0.49，均在0.5以下，对照组脾菌分离数对数值的平均值为5.00±0.59～5.74±0.47，均在5以上，长期免疫后BCG接种组仍保持良好的保护力。以BCG接种组与对照组脏器结核分枝杆菌分离数的差值为评价指标，免疫28周后差值为3.28(P<0.05)，免疫60周后差值为3.97(P<0.05)[18-19]。结果提示，我国生产用BCG菌株具有优良动物保护力，这给新疫苗超越其保护效果增加了难度。

因此，在我国目前使用的BCG菌株具有优良动物保护效果的前提下，以BCG为基础的新疫苗要获得超过现用BCG的动物保护力具有相当难度。

4 结语

综上所述，以BCG为基础的新疫苗其保护力可能超过现用BCG，但要显著提高其对成人的保护效果尚有难度；新疫苗的新生儿临床研究，因存在伦理问题可能无法开展；潜伏结核感染人群的免疫预防是控制结核病的重要手段，而以现用BCG为基础的新疫苗可能无法应用于此类人群的预防。因此，新一代主流抗结核分枝杆菌疫苗将不会是建立在现用BCG基础之上的疫苗。

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. WANG Guozhi, E-mail: tbtestlab@nifdc.org.cn

Potential limitations and practical concerns regarding “new generation tuberculosis vaccine based on current bacillus Calmette-Guérin”

ZHAO Aihua, XU Miao, WANG Guozhi

DivisionofTuberculosisVaccines,NationalInstitutesforFoodandDrugControl,Beijing100050,China

One of the major efforts for the next generation vaccine for tuberculosis prevention is based upon bacillus Calmette-Guérin (BCG). The potential limitations and practical concerns regarding “new generation tuberculosis vaccine based on BCG” are presented in this paper. The practical challenge in designing, the concerns for preclinical pharmacodynamic evaluation and effective clinical evaluation are discussed. We concluded that although a new BCG-based vaccine may reach the goal for better protection than the current BCG, it is difficult to significantly improve the protection for adults. The trials of new vaccines in newborns may not be conducted due to the ethical issues. Control of latent tuberculosis infection is a key step for the prevention of tuberculosis and the new vaccines may not be applied in this population. Therefore, we need new strategies for new generation of mainstream tuberculosis vaccines as there are significant hurdles on the path for BCG-based research and development.

Tuberculosis; Vaccine; Bacillus Calmette-Guérin

“十二五”国家科技重大专项(2012ZX10004701)

王国治

2016-06-18)