全球结核病疫苗研究进展

王洪海

复旦大学生命科学学院，上海 200433

·特约专稿·

全球结核病疫苗研究进展

王洪海

复旦大学生命科学学院，上海 200433

本文旨在对全球结核病疫苗研究进展进行系统综述，描述国际上目前进入临床试验不同阶段的新型疫苗，包括重组卡介苗、亚单位疫苗、治疗性疫苗等，分析我国结核病疫苗研究现状，介绍国际研究发展趋势，如人类疫苗计划、全细胞疫苗、多阶段疫苗等，并对存在的问题和挑战进行讨论，展望未来发展趋势。

结核病；结核病疫苗；重组卡介苗；全细胞疫苗；亚单位疫苗

1 全球结核病严峻形势和发展新型结核病疫苗的必要性

结核病是全球范围内的重大传染病，是由结核分枝杆菌引起的复发和再发传染病。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)2016年10月13日全球结核病报告显示[1]，2015年全世界估计共有1 040万例新发结核病，约180万例死于结核病，其中40万例合并感染人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)。结核病仍是2015年全球十大死因之一，因病致死人数高于艾滋病和疟疾，是传染病死亡人数之首。

中国是世界上22个结核病高负担国家之一[2]，结核病患者数量居世界第3，其中80%的患者在农村，75%为青壮年。结核病是中国农村因病致贫、因病返贫的主要疾病之一，严重制约我国经济和社会的发展。《中国结核病年鉴(2016)》报告了中国结核病的“六多”现象：一是感染人数多；二是患病人数多；三是新发患者多，2015年发病数为91.8万，占全球8.8%；四是死亡人数多，2015年中国结核病死亡率为2.7/10万，死亡数为3.5万；五是农村患者多，全国约80%的结核病患者集中在农村，且主要在经济不发达的中西部地区；六是耐药患者多，2015年全国结核病耐药患者约7万。

结核病卷土重来的主要原因[3]：卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)免疫效果降低；耐多药结核分枝杆菌(multi-drug resistantMycobacteriumtuberculosis，MDR-TB)播散；HIV与结核分枝杆菌双重感染；人口大规模流动。

预防重大传染病，疫苗起到关键作用，这是现代医学取得的最大成就之一。人类寿命从20世纪20年代的40～50岁增加到现在的70～80岁，疫苗功不可没。接种疫苗，根除了天花，几乎消灭了脊髓灰质炎，预防了很多传染性疾病引发的大规模流行。为实现全球控制结核病的目标，降低其发病率和死亡率，人们迫切需要研制新型抗结核病疫苗[4]。

2 BCG预防结核病的效果分析及提高其效果的对策

2.1 BCG预防结核病的现状

BCG是在WHO扩大免疫接种计划指导下全球广泛使用的唯一结核病疫苗[5]。该疫苗自1921年发明至今，为全球唯一的临床用婴儿期结核病预防疫苗，有161个国家和地区使用，可预防和减轻儿童重症结核病。BCG自1923年使用以来，全球约有40亿人接种，对结核病的预防功不可没。但随着时间推移，其预防结核病的不足日益明显，大规模流行病学调查表明BCG的保护作用并不理想[6]。研究表明，BCG对预防儿童严重肺结核有效，但对成人结核病和结核分枝杆菌潜伏感染无保护效果。其对成人肺结核的保护率为0～80%不等，复种无效。作为婴儿期疫苗保护期短，仅5～10年[7-8]。因此，发展增强型重组BCG取代现有BCG是婴儿期结核病预防疫苗研究的最佳选择。

2.2 BCG免疫效果变化分析

针对目前BCG免疫效果降低的态势，科学家大规模、高深度分析了近年来临床上使用的BCG，发现保护作用差异大的原因如下：BCG丢失了某些结核分枝杆菌特异性抗原[9]；环境分枝杆菌的作用使BCG在体内受到抑制，不能引起有效的免疫保护作用；BCG菌株、剂量和接种方案存在差异；人群基因差异；结核分枝杆菌基因差异等。

2.3 增强BCG有效性的主要途径[10]

增强BCG的免疫效果，目前正在探索两个主要途径。一是提高BCG本身的免疫能力，如重组BCG。①过表达BCG保护性抗原 Ag85B等；②引入BCG缺失的RD区抗原基因，如ESAT-6、Rv3425等；③激活更有效的免疫反应，加入人类细胞因子γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)、白细胞介素2(interleukin 2，IL-2)等；④改善BCG生存环境，减少免疫系统对BCG的干扰，改变BCG的抗原呈递，增加细胞凋亡能力，逃避吞噬体，如重组疫苗rBCGΔUreC∶Hly。上述策略构建的增强型重组BCG继承了原始BCG的特性，可对婴幼儿提供保护；免疫原性和保护性增强，保护期延长，可对成人提供保护，具有巨大的发展潜力和应用价值。二是在BCG免疫后，用亚单位疫苗进行加强。

3 全球结核病疫苗研究进展

全球范围内结核病发病率下降缓慢以及受MDR-TB持续威胁，迫使人们尽快研制比BCG更有效的预防结核病的疫苗。根据“全球防治结核病计划”(Global Plan to Stop TB)，2006～2015年新型高效的结核病疫苗介入将是2050年达到消灭结核病目标的一个重要组成部分。截至2016年，WHO 2016年度全球结核病报告总结了国际结核病疫苗的研究进展[1](图1)。

由图1可知，目前进入全球临床试验的13个结核病新型疫苗如下。

按临床试验阶段划分： Ⅰ 期有5个，为MTBVAC、Ad5Ag85A、ChAdOx1.85A/MVA85A、MVA85A(Aerosol)、TB/FLU-04L；Ⅱa期有5个，为DAR-901、RUTI、H1/H56∶IC31、H4∶IC31(AERAS-404)、ID93+GLA-SE；Ⅱb期有2个，为VPM1002(Max Planck)、M72+AS01E；Ⅲ期有1个，为M.vaccae。

按疫苗的免疫策略划分[11]：初次免疫有6个，为Ad5Ag85A、MTBVAC、MVA85A、VPM1002、H1、H56；加强免疫有11个，为 Ad5Ag85A、MVA85A、VPM1002、H1、H4、H56、M72等；感染后免疫有6个，为 Ad5Ag85A、 MVA85A、H1、H56、RUTI、M72；免疫治疗有3个，为RUTI、MVA85A、M.vaccae。

按疫苗的结构类型划分：①重组BCG[12]：VPM1002和AERAS-422。VPM1002 将产单核细胞李斯特菌Hly整合至BCG，即 rBCG∷ΔUreC-Hly+。Hly可在吞噬体膜上穿孔。尿素酶C缺失可保证吞噬体中的酸性环境，以保证Hly活性所需pH值。穿孔可促进抗原转运至细胞质，有利于致敏，而感染的细胞发生凋亡。目前处于Ⅱa期临床试验。另一个重组疫苗AERAS-422，由于加入了产气荚膜梭菌溶血素(perfringolysin)，引起了疫苗安全性问题[13]。②病毒为载体的疫苗：MVA85A、AERAS-402和Ad5Ag85A。MVA85A 由英国牛津大学 Helen McShane 课题组研制，以改进的安卡拉牛痘病毒(modified vaccinia virus Ankara，MVA)表达结核分枝杆菌抗原Ag85A[14]。缺陷的痘苗病毒虽然不能在哺乳动物细胞中复制，但可表达蛋白，诱导强T细胞应答，并在多年前接种BCG的个体中诱导回忆性应答，仅观察到轻微的不良反应，在潜伏感染者中也有相似的免疫效果。该疫苗完成Ⅱb期临床试验后，在南非进行Ⅲ期临床试验，对2 797名婴儿随机使用BCG或BCG+该疫苗，随访2年，发现其预防效果与对照组没有区别。英国牛津大学和AERAS研发的MVA85A疫苗曾被寄予厚望，但在Ⅲ期临床试验遭遇滑铁卢[15]，需总结经验教训。③蛋白亚单位疫苗：有M72、H1、H4、H56，主要用于BCG接种后的免疫加强。M72 是Mtb32和Mtb39的嵌合蛋白，加佐剂 AS01E，进入丹麦Ⅱb期临床试验[16]。H1为Ag85B-ESAT-6融合蛋白，进入美国Ⅱa期临床试验[17]。H4为Ag85B-TB10.4融合蛋白，进入法国Ⅱa期临床试验[18]。H56由结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白组成，包含早期分泌蛋白Ag85B、ESAT-6 和潜伏感染相关蛋白Rv2660c，相当于H1+Rv2660c融合蛋白，进入丹麦Ⅱa期临床试验[19]。④杀死的细胞提取物：M. vaccae和RUTI。M. vaccae为灭活的母牛分枝杆菌，由中国安徽龙科马集团完成[20]。作为治疗性疫苗使用，正在进行Ⅲ期临床试验。目前在中国疾病预防控制中心的指导下，针对潜伏感染者进行疫苗的有效性和安全性试验。RUTI是西班牙科学家将灭活的结核分枝杆菌的全部碎片组分去除毒素并包裹在脂质体内研制而成[21]，在南非进入Ⅱa期临床试验，主要用于治疗结核病。

图1 2015年全球结核病疫苗研究进展[1]

Fig.1 Progress onMycobacteriumtuberculosisvaccine development in the world in 2015

4 国内结核病疫苗研究现状

在 “十一五”“十二五”国家科技重大专项的支持下，国内科研院校、企业单位进行了结核病预防性疫苗、亚单位疫苗、病毒载体疫苗及治疗性疫苗的研究。

4.1 预防性疫苗

复旦大学构建了多株重组BCG疫苗，如rBCG∷Ag85B-Rv3425[22]等，通过动物免疫攻击保护实验，检测动物生存时间、组织内细菌变化、病理组织改变、切片抗酸染色、肺水肿等指标，筛选了2株保护效果优于BCG的重组疫苗，正在进行临床前试验。四川大学构建了多基因重组BCG[23]，免疫效果显著而稳定，可在小鼠体内引起良好的免疫反应，能有效抵抗H37Rv的攻击，保护效果优于BCG，目前正在进行新型多基因重组BCG的安全性评价和工艺学研究。华中科技大学获得1株保护性显著增强的重组BCG疫苗rBCG∷AB[24]，并进行了重组疫苗免疫加强研究。

4.2 亚单位疫苗

兰州大学开展了亚单位疫苗研究，完成了ESAT6-Ag85B-Mpt64(190-198)-Mtb8.4(缩写EAMM)等9个融合蛋白的保护效率实验，筛选出EAMM具有最佳保护效果[25]。中国药品生物制品检定所进行了重组亚单位疫苗AEC/BC02的临床试验研究[26]。

4.3 以病毒为载体构建的结核病疫苗

国内主要以痘苗病毒、腺病毒、仙台病毒为载体构建结核病新型疫苗，主要用于免疫加强或预防性免疫。上海生物制品研究所将MVA为载体的新型重组疫苗用于结核分枝杆菌感染的猴模型，观察其体内免疫预防及治疗作用[27]，发现重组MVA-Ag85A作为BCG初次免疫后的加强免疫,在猴模型中能产生较BCG单次免疫更好的免疫保护作用。天津康希诺生物技术有限公司构建了腺病毒为载体的新型结核病疫苗Ad5Ag85A，正在进行临床试验[28]。上海市公共卫生临床中心应用仙台病毒作为抗结核病疫苗载体，构建了一种表达结核分枝杆菌抗原Ag85A和Ag85B的重组仙台病毒载体疫苗SeV85AB，已进行了黏膜免疫研究[29]。

4.4 治疗性疫苗

研究表明，多种DNA疫苗具有潜在免疫治疗作用。1999年，英国帝国理工大学 Lowrie等[30]将DNA疫苗用于结核病的治疗。他们首先给小鼠静脉注射结核分枝杆菌H37Rv株8周，制作结核分枝杆菌感染小鼠模型；然后分别给予HSP65、HSP70、ESAT-6和MPT70 基因的DNA疫苗，以及IL-12 DNA和BCG治疗。结果发现，IL-12和HSP65 DNA疫苗可有效增加小鼠对结核分枝杆菌的清除率，HSP70次之，MPT70和ESAT-6作用较小，而BCG无效。我国科学家也进行了结核病治疗性疫苗的研究。中国人民解放军第309医院构建了4种新型治疗性DNA疫苗[31]，正在进行安全性评价。安徽龙科马集团正在进行“微卡”(灭活的母牛分枝杆菌)的Ⅲ期临床试验[32]。我国结核病疫苗研究现状见表1。

由表1可见，我国与国际结核病疫苗研究的差距主要体现在以下几方面。①国际上进入临床试验的疫苗有13个，我国疫苗仍处于临床前研究，尤其缺少预防性疫苗。②疫苗专利：我国疫苗研究基本上是模仿，极少有知识产权，迄需源头创新。③我国疫苗基础研究力量薄弱，需规范和加强疫苗临床试验。④我国研制的疫苗种类不多，与国际有很大差距。

5 结核病疫苗的发展趋势

5.1 发展趋势之一：人类疫苗计划[33]

妨碍疫苗发展的主要问题如下：①如何使疫苗在人体产生特异、有效、广泛、持久的免疫反应；②何种病原体特异性或肿瘤特异性抗原能产生保护性免疫；③如何在不同人群中使疫苗达到最优效果等。同时，强调在抗原发现、新型载体、佐剂技术等方面加强研究将有助于疫苗的研发。

表1 中国结核病疫苗研究现状

Tab.1Mycobacteriumtuberculosisvaccine development in China

疫苗名称主要组成研究阶段研究单位预防rBCG∷ARrBCG∷Ag85B-Rv3425临床前研究复旦大学[22]预防rBCG∷GCErBCG∷G-CFP10-E6小鼠保护实验四川大学[23]初免加强rBCG∷ABrBCG∷Ag85A-Ag85B小鼠保护实验华中科技大学[24]亚单位疫苗EAMMESAT6-Ag85B-Mpt64-Mtb8.4小鼠保护实验兰州大学[25]亚单位疫苗AECAg85B-ESAT6-CFP10临床前研究中国食品药品检定研究院[26]治疗性疫苗(4株)Ag85A/BDNA临床前研究中国人民解放军第309医院[31]治疗性疫苗(微卡)母牛分枝杆菌菌体蛋白Ⅲ期临床试验中国药品生物制品检定所[32]

图2 人类疫苗计划蓝图[33]

Fig.2 Blueprint for the human vaccine programme

5.2 发展趋势之二： 全细胞疫苗研究[34]

目前进行的结核病疫苗临床试验遇到挫折，分析原因发现，不管是病毒载体构建的疫苗还是各类亚单位疫苗(包括各类DNA疫苗)，免疫效果很难达到BCG的效果。英国牛津大学用病毒作为载体，表达有重要作用的目的基因，原本希望利用病毒的细胞免疫功能来增强目的基因的免疫效果，但MVA85A的Ⅲ期临床试验结果表明，与空白对照相比没有明显效果。一个病毒有200个左右基因组，BCG有4 000个基因组，激发免疫的程度不在一个数量级上。2014年7月9日，德国马普传染病研究所和美国AERAS疫苗公司在小范围内召集国际结核病疫苗研究专家，研讨当前结核病疫苗研发存在的问题和趋势，一致比较看好全细胞结核病疫苗(Kaufmann SHE，2012，CurrOpinBiotech)。除以BCG为基础构建的重组BCG外，人们还关注其他分枝杆菌(如鸟型分枝杆菌、母牛分枝杆菌)的提取物等。

5.3 发展趋势之三：发现新的免疫标记

①发现新的抗原：未来结核病疫苗研发中的一个重要内容就是发现新的生物标记，因此需扩大候选抗原的筛选范围，包括潜伏期、治疗期、恢复期抗原的筛选[35]。②发现新的疫苗评价标记：研究发现很多免疫指标与疫苗的最终保护效果不一致，因此需发现机体免疫反应的新型标记，尤其是发现结核病免疫相关的各类细胞因子，以甄别哪些具有保护作用[36]。

5.4 发展趋势之四：发展新型多阶段功能疫苗[37]

①预防性疫苗：研制免疫保护力强于BCG的疫苗，如重组BCG(针对婴幼儿免疫)。②发展新型多阶段功能疫苗，包括治疗性疫苗。③研究针对不同人群(青年、老年)的疫苗。④研究初始免疫-增强免疫策略：研制有效的亚单位疫苗(包括以病毒为载体、DNA、蛋白多肽等形式)，加强初始免疫的保护效果。

6 结核病疫苗研究存在的问题、对策和展望

6.1 存在的问题

①结核分枝杆菌免疫机制问题[38]：尚未充分理解人体如何产生精确有效、广泛持久的免疫反应，包括疫苗诱导的免疫能力随时间的衰退、用于预测疫苗免疫原性和功效的先天标记、用于预测疫苗免疫反应性或安全性的标记。②特异性抗原问题[39]：目前结核病疫苗的研究处于瓶颈期，单独增加一两个抗原是否能提高BCG的作用？是否应从结核分枝杆菌感染机制出发，更好地设计疫苗？③动物模型的限制[40]：将动物模型用于预测人体内疫苗诱导的免疫反应和效果具有严重局限性，且不相关。④人群特异性问题：需使疫苗在不同人群中的功效达到最优， 包括新生儿、老年人、潜伏感染者和耐药者。⑤如何正确评价BCG的免疫保护作用[41]和免疫策略问题[42]。

6.2 对策

①分析目前疫苗临床试验失败的原因[43]：外加有毒因子；病毒载体基因组小；疫苗试验时间和剂量问题；缺乏针对不同阶段(婴幼儿、青壮年、老年人)的疫苗；缺乏针对不同人群(潜伏感染者、耐药者、免疫缺陷者)的疫苗。②研究目前全球范围内BCG母体。复旦大学进行了13株BCG菌株的遗传和生化比较研究，从基因组角度分析菌株之间的差异，利用动物模型完成了所有BCG菌株的安全性和保护性评价，以便选择更好的BCG母体作为构建重组BCG的原始载体[44]。③吸取BCG研究的经验教训[45]。目前全球比较看好全细胞结核病疫苗，这是在吸取国际结核病疫苗研究经验教训的基础上取得的共识。目前全球有160个国家和地区使用BCG预防儿童结核病，证实对婴幼儿有效。BCG是人工定向变异而获得的毒力减弱或基本无毒的牛型结核分枝杆菌，BCG接种是活菌免疫、全菌免疫，疫苗在体内的时间持久，有效成分多，免疫原性强，具有很好的保护性和安全性[46]。目前所研制的各类亚单位疫苗和DNA疫苗很难达到BCG的免疫效果，使用病毒作为载体构建的疫苗如MVA85A疫苗的Ⅲ期临床试验结果表明，与空白对照相比没有明显效果。上述系列研究表明，利用BCG、改造BCG是可行途径。因此，今后应在BCG的基础上增强BCG免疫效果和在不同年龄阶段给予免疫加强。

6.3 展望

近20年来，结核病疫苗主要为重组BCG疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗及以病毒为载体的重组疫苗[47]。经过近几年的临床试验，发现全细胞结核病疫苗的免疫保护效果最好。因此，未来结核病疫苗的发展方向如下。①初始免疫用疫苗：研制免疫保护力强于BCG的疫苗以替代BCG，如重组BCG[48-49]，发展全细胞疫苗。②新的初始免疫+增强免疫策略：采用免疫活性强的改良BCG初始免疫+亚单位疫苗(包括以病毒为载体、DNA、蛋白多肽等形式)增强免疫的策略，加强BCG或重组BCG的免疫保护效果[50-51]。增强免疫的策略有望使机体对结核分枝杆菌的免疫防护维持在较高水平，可探索不同免疫途径，如呼吸道免疫。③发展新型多阶段功能疫苗：一方面，针对结核分枝杆菌感染的不同阶段，如感染初期、潜伏感染、耐药；另一方面，针对不同人群，包括针对婴幼儿的预防性疫苗，针对潜伏感染人群的预防性疫苗或治疗性疫苗，针对活动性结核病患者的药物与疫苗联合使用的免疫治疗等[25,52]。④研发治疗性疫苗：耐药结核病的出现及HIV与结核分枝杆菌双重感染，使耐多药结核病几乎无法可治，因此将治疗性疫苗与抗结核药物联合使用，是治疗耐多药结核病的一线希望[20]。结核病疫苗的发展目前处于分水岭时期，新型疫苗刚刚冒出地平线，疫苗研究任务艰巨，疫苗成果造福人类还需多方位协助和配合。

消灭结核病迄需新型疫苗[53]。结核病不仅仅是医学问题，更是社会公共卫生问题，对社会稳定、经济发展具有重要影响。联合国于2015年通过了2030年可持续发展目标，其中一个具体目标是终结全球结核病流行。2014年世界卫生大会上WHO“终结结核病战略”呼吁，在2015年基础上，至2030年将结核病死亡数减少90%，发病率降低80%。因此，结核病的控制需科学层面和社会管理层面多方位的共同努力，从而为建立一个无结核病的世界努力奋斗[54-55]。

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. WANG Honghai, E-mail: hhwang@fudan.edu.cn

Progress onMycobacteriumtuberculosisvaccine development

WANG Honghai

SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200043,China

The present paper summarized the global status onMycobacteriumtuberculosis(M.tuberculosis) vaccine development. Novel tuberculosis vaccines in clinical and pre-clinical trials are listed. The new tuberculosis vaccine candidates include recombinant bacillus Calmette-Guérin (BCG), subunit vaccines and therapeutic vaccines. The status of research on new tuberculosis vaccines in China is analyzed. The review also introduced the development tendency of tuberculosis vaccines in the world, such as Human Vaccines Project, whole cell vaccine, multistage subunit vaccines, etc. The issues, opportunities and challenges for tuberculosis vaccine research and development in the future were discussed.

Tuberculosis;Mycobacteriumtuberculosisvaccine; Recombinant bacillus Calmette-Guérin; Whole cell vaccine; Subunit vaccine

“十二五”国家科技重大专项(2012ZX10003008)

王洪海

2017-07-03)