松叶牡丹离体快速繁殖及瓶苗微型化培育技术研究①

黄志明 沈仕泰

(莆田学院环境与生物工程学院，福建莆田351100)

松叶牡丹离体快速繁殖及瓶苗微型化培育技术研究①

黄志明 沈仕泰

(莆田学院环境与生物工程学院，福建莆田351100)

应用植物离体快繁技术对松叶牡丹瓶苗微型化培育技术的研究，结果表明：松叶牡丹的种子用0.1%的氯化汞灭菌5 min效果最理想，成活率达到73.3%；最佳的增殖培养基配方：MS+6-BA 1.0 mg·L-1+ IBA 0.05 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂9 g·L-1；对松叶牡丹的壮苗情况来看，PP333的最佳质量浓度为 0．5 mg·L-1，芽苗在的培养基为MS+NAA 0.25 mg·L-1+ PP3330.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂9 g·L-1， 植株矮壮,茎粗,叶片厚,茎叶红,根系发，有利瓶苗的花芽分化.

松叶牡丹,培养基,快繁,矮化,微型化

松叶牡丹(Lampranthustenuifolius;)，又名半支莲，太阳花，马齿苋科.一年生肉质 草本，花顶生，直径2.5-5.5 cm，基部有叶状苞片，花瓣单瓣或重瓣，有白、粉、黄、橙、桃红、紫红等颜色或具斑纹的复色等品种不仅花色丰富、色彩鲜艳，景观效果极其优秀[1].

用离体快速繁殖技术，周期短, 繁殖快, 节省空间，显著缩短新品种由选育到推广所需的时间[2].通过离体快速繁殖培养, 由一块很小的, 甚至是极微的植物组织, 在一年之内可以产生百万以上植株, 如此高的繁殖速度是任何传统的无性繁殖方法所不能达到的[3].本试验在不改变松叶牡丹遗传变异的基础上，对松叶牡丹离体快速繁殖及瓶苗微型化培育技术进行研究.为建立稳定的快速繁殖花卉体系，提供良好的试验平台， 并为该花卉资源的开发利用提供技术支持和理论参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验松叶牡丹种子由北京市芳萱苑种子有限公司提供.

1.2 试验方法

1.2.1 不同灭菌时间对松叶牡丹外植体萌发的影响.(1)取松叶牡丹种子，置于自来水中冲洗约二十分钟.(2)用酒精消毒0.5 min，再分别用1 .2 g·L-1的升汞灭菌3、4、5、6、7 min.(3)灭菌后均用无菌水冲洗5次.(4)在无菌室超净工作.

将种子接在事先灭菌好的MS培养基，每个灭菌时间段的种子接种3瓶，每瓶接10个.15 d后观察种子的萌发情况与染菌情况并做分析.

1.2.2 不同浓度的6-BA和IBA配比对松叶牡丹增殖的影响.种子发芽至3.0 cm左右的时候，取其顶芽2.0 cm的无菌茎段在MS+6-BA(0.5、1.0、1.5 mg·L-1)+IBA(0.05、0.10、0.15 mg·L-1)增殖培养基中培养20 d后记录其增殖情况.

1.2.3 不同浓度的PP333对松叶牡丹生根、矮化、和壮苗的作用.将增殖后生长较为健壮无菌芽段切下来，分别接种到MS+PP333(0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 mg·L-1)+ NAA0.25 mg.L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂9 g·L-1培养基上培养20 d之后，记录生根率及苗的生长状况.

1.2.4 培养基和培养条件.试验均用MS为基本培养基，MS中使用的蔗糖浓度为30 g·L-1，琼脂浓度为9 g·L-1，光照强度为2 000 lx ,光照周期为13 h·d-1, 培养室温度为(26±1) ℃.

2 结果与分析

表1 消毒灭菌时间对松叶牡丹种子萌发效果的影响

灭菌时间/min平均死亡率/%平均污染率/%平均萌发率/%3328.366.74527.070.05818.773.361538.346.772456.020.0

2.1 不同灭菌时间对松叶牡丹种子萌发的影响

设计6种不同的消毒时间，对松叶牡丹种子进行灭菌和萌芽效果研究(表1) .结果表明: 灭菌时间越短，污染率越高; 随着灭菌时间的延长，种子污染率降低，但在5 min以后萌发率也开始降低.结果表明种子最佳灭菌时间为5 min，萌发率达到73.3%.

2.2 不同浓度的6-BA和IBA对松叶牡丹瓶苗增殖的影响

将松叶牡丹无菌苗切成带顶芽的长度在 1．0 cm 左右的茎段， 接种在添加不同质量浓度6-BA和IBA的MS培养基中培养，30 d 后统计增殖系数(表2) .

表2 6-BA和IBA对松叶牡丹增殖的影响

注：培养基：MS；蔗糖：30 g·L-1；琼脂：9 g·L-1.

图1 萌发增殖瓶苗

试验结果(表3)表明:不同浓度的6-BA和IBA对松叶牡丹芽的增殖系数影响显著，由极差R的大小可以得出两种激素的主次因素：6-BA>IBA.影响松叶牡丹增殖最主要的因素是6-BA，其次IBA.松叶牡丹增殖培养基最佳组合的方案：MS+6-BA 1.0 mg·L-1+ IBA 0.05 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+琼脂9 g·L-1.(图1).

2.3 植物生长抑制剂PP333对松叶牡丹壮苗和生根的影响

在继代增殖3次后，再用MS培养基附加不同浓度的PP333进行壮苗培养30 d后观察植株生长情况并测量株高.各处理组合接种30个外植体，2 次重复.结果见表3.

表3 PP333 浓度对松叶牡丹壮苗的影响

注：培养基：MS；NAA：0.25 mg·L-1；蔗糖：30 g·L-1；琼脂：9 g·L-1.

试验结果(表3)表明， 较低浓度的 PP333对植株的生长影响不大，植株细长，茎杆纤细， 不利于茶花凤仙瓶苗壮苗和生根; 较高质量浓度的PP333抑制植株生长， 植株矮，生长缓慢.在添加PP3330.5 mg·L-1培养基上生长的植株矮壮，茎粗，叶片厚，茎叶红，根系发达,生长速度适中， 这种植株适合于瓶苗的花芽分化,如图2，图3.

图2 含0.3浓度的 PP333培养瓶苗图 图3 含0.5浓度的 PP333培养瓶苗图

3 结论与讨论

松叶牡丹作为优良的园林观赏花卉，而能作为室内外盆栽观花、观叶植物，市场需求量很大.对松叶牡丹开展离体成花培养技术研究，对指导松叶牡丹生产实践具有重要意义.以松叶牡丹种子为外植体进行组织培养， 通过组织培养的方法快速繁殖，不仅减少了病毒重新感染的机会，而且通过外植体接种培养， 进一步降低了基础苗中病毒的含量，使快繁得到的脱毒，种苗更健壮，以提高生长后应用价值[4].

(1)选用饱满健康的松叶牡丹种子为试验材料是试验成功的关键.外植体消毒处理时间不够、不彻底或接种培养时操作失误等都会使污染机会增加，所以要严格无菌操作, 仍需探索减少污染的方法[5].对试验材料进行表面灭菌时， 既要考虑植物材料的耐受能力， 也要考虑药剂的消毒效果， 不同材料类别、不同药剂种类，甚至不同器官都应区别对待[6].试验结果得出最佳的种子萌发消毒方案为1.2g·L-1的升汞灭菌时间为5 min，萌发率达到73.3%.

(2)国内外大量研究结果表明，在植物离体快繁技术培养中，生长激素主要被用于细胞的分裂和根的伸长分化，而细胞分裂素的主要作用则是促进细胞分裂和分化，诱导胚状体和不定芽的形成及离体成花调控，生长激素与一定量的细胞分裂素配合常用于不定芽的诱导[7].增殖培养中，细胞分裂素6-BA有着促进细胞分化和促进腋芽生长等作用，生长素IBA则是促进细胞的分裂[8,9]. 植物处于生长发育的各个阶段都会受到激素的调节与控制,正确的比例是芽分化生长增殖的关键[10].其中培养基中激素种类和浓度是主要影响因素，浓度过高过低都会影响分化、增殖和最终成活率[11].达克东等研究， 在确定继代培养配方和生根培养配方的试验时，可以看出，激素浓度过低，对于茎段诱导能力较弱，芽萌发速度慢，丛生芽增殖数受到了限制，根的长势较弱，根量少；激素浓度过高，也会抑制丛生芽的生长，从而降低了丛生芽的增殖数， 虽然刺激了根的加粗，但是根量较少[12].激素条件对红掌腋芽初代培养的影响 激素条件不仅影响着红掌腋芽分化能力，同时还决定着不定芽分化的途径. 在适宜的培养基条件下，红掌腋芽能通过直接器官发生途径直接产生不定芽，试验证明，当培养基中添加细胞分裂素 6-BA 1.0 mg/L、生长素 IBA 0.1 mg/L，此种培养基能很好地诱导腋芽分化[13].以MS为基本培养基， 采用正交试验设计方法研究不同浓度的的细胞分裂素和生长素及组合对芽增殖的影响[14].从表2试验结果表明:松叶牡丹增殖培养基最佳组合的方案：MS+6-BA 1.0 mg·L-1+ IBA 0.05 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+琼脂9 g·L-1(图1). 这也与王越和刘燕在大旗瓣凤仙花上的研究中也得到相同的结论[15].

(3)多效唑(PP333) 作为植物生长延缓剂，在植物体内抑制内源激素 GA 的生物合成，对提高植物抗逆性、促进壮苗生根都有重要作用，并已广泛应用于大田和观赏植物[16].PP333是一种高效且低毒的植物激素，PP333处理能有效控制植株高度，使茎更短，叶片面积缩小并且增厚，使叶片变得更丰厚，提高根系活力[16].陈炫等研究发现叶面喷施多效唑和乙烯利混合剂，能有效抑制妃子笑荔枝抽生冬梢， 促进花芽分化，提高成花率;还能提高荔枝树内源 ABA、 ZR、 ABA /IAA、 ABA /GA3、 Z R /IAA、 ZR /GA3 值， 降低IAA和GA3含量， 提高可溶性糖、 淀粉、 全氮含量，增加 C /N 比值，从而提高成花率[17].

近年来人们开始将 PP333应用于植物组织培养中，用于矮化植株，使叶形指数变小[18].植物生长抑制剂PP333对松叶牡丹壮苗和生根的试验结果表明:添加质量浓度为0.5 mg·L-1的PP333，培养植株矮壮,茎粗,叶片厚,茎叶红,根系发达，有利瓶苗的花芽分化.试验结果表明:松叶牡丹壮苗最佳培养基配方为MS+NAA 0.25 mg·L-1+PP3330.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂9 g·L-1.

本试验对松叶牡丹离体快速繁殖及瓶苗微型化培育技术研究，对促进微型化花卉工厂化生产提供理论依据.对营养生长转入生殖生长机理有待进一步研究.

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Techniques Onin-vitro Rapid Propagation and Miniaturization cultivation of Bottle Seedling forLampranthustenuifolius

HUANG Zhim-ing SHEN Shi-tai

(Faulty of Environment and Biological Engineering，Putian University，Putian 351100, China)

Techniques about in-vitro rapid propagation for miniaturization breeding ofLampranthustenuifoliuswere presented. Results show that the way that utilizes 0.1% mercuric chloride liquid to sterilize seeds ofLampranthustenuifoliusfor 5 minutes is the best, and the survival rate of these seeds can reach 73.3%. Optimum culture medium for proliferation includes MS+6-BA 1.0 mg·L-1+ IBA 0.05 mg·L-1, sucrose 30 g·L-1and agar 9 g·L-1. Additionally, growth of strong seedling illustrates that the best mass concentration of PP333is 0.5 mg·L-1. Culture medium for bud seedling contains MS +NAA 0.25 mg·L-1, PP3330.5 mg·L-1，sucrose 30 g·L-1and agar 9 g·L-1. These plants are short but strong, and they have well developed root system, thick and red stems as well asleaves. It is beneficial to the in-vitro flower bud differentiation.

Lampranthustenuifolius, culture medium, rapid propagation, dwarf, miniaturization

2017-03-10

福建省教育厅科技项目(JB12177)资助

黄志明，E-mai:blackjacket@126.com.

S681.1

A

1672-6634(2017)02-0056-04