不同药载比的紫杉醇白蛋白纳米粒的制备及释药性能研究①

蔡 畅 赵燕娜 刘 敏

(聊城大学生物制药研究院,山东聊城252059)

不同药载比的紫杉醇白蛋白纳米粒的制备及释药性能研究①

蔡 畅 赵燕娜 刘 敏

(聊城大学生物制药研究院,山东聊城252059)

紫杉醇作为治疗癌症的有效药物具有很强的抗癌效果和广谱治疗范围.紫杉醇白蛋白纳米粒可提高其溶解度和生物利用率.本文采用注入法制备不同药载比(紫杉醇/牛血清白蛋白)的紫杉醇白蛋白纳米粒，考察了其粒径及释药性能.以药载比为9∶1制备的纳米粒的粒径最小，颗粒最均匀并且其释放速率最慢，有较好的缓释效果.考察药载比为9∶1制备的纳米粒的稳定性及载药量.放置一周后其粒径没有太大变化判断其稳定，计算载药量为11.45%.

紫杉醇，牛血清白蛋白，纳米粒，药载比，药物释放，稳定性

0 引言

紫杉醇(paclitaxel，PTX，图1A)作为阿霉素之后最热点新型的抗癌药之一，在肿瘤相关治疗领域中具有重要的意义.紫杉醇是由太平洋紫杉等红豆杉属植物中提取的一种抗癌作用优良的二萜类化合物.紫杉醇的抗癌机制是通过促进极为稳定的微管聚集的同时阻断微管正常生理性的解聚(在细胞分裂周期中的G2和M两个期)，从而导致细胞死亡，达到阻碍肿瘤生长的目的.目前广泛应用于非小细胞性肿瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等.然而，紫杉醇在水中的溶解度极低(0.77 μmol/L左右)，因此不能直接作为临床药物应用于癌症的治疗[1-5].

在当前国产和进口的紫杉醇注射剂中都是以乙醇和聚氧乙烯蓖麻油作为助溶的载体，聚氧乙烯蓖麻油会导致出现极为严重的超敏反应现象[3].因此，能够研制出副作用相对小的紫杉醇制剂已迫在眉睫.高分子纳米粒子作为药物载体可以弥补传统药物制剂中的缺陷与不足.目前在国内临床研究方面，我国所研发的紫杉醇脂质体已开始在临床上应用，并且显示出了良好的应用前景.紫杉醇-白蛋白纳米混悬剂是用人血白蛋白来包裹紫杉醇所形成的纳米粒，可以将紫杉醇稳定的分散于水溶液之中，减少了所带来的副作用.由于纳米粒的粒径极小所以具有被动的靶向性，在肿瘤细胞上存在着特殊的载体能够主动摄取白蛋白，显示了白蛋白纳米粒技术所具有的优越性[6].但是作为载体的人血白蛋白资源稀缺、价格较高，并且专利费昂贵，从而造成医疗成本很高[7].

牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA，图1B)也具有包裹紫杉醇的能力[7]，紫杉醇-白蛋白纳米混悬剂是由牛血清白蛋白包裹了紫杉醇形成的纳米粒，使紫杉醇能够稳定的分散于水溶液中，从而避免了表面活性剂所带来的副作用，并提高抗肿瘤活性.然而目前国内还没有白蛋白纳米粒药物上市，主要的原因是对紫杉醇和白蛋白之间的相互作用、制备工艺及影响因素的科学研究还不成熟，前期纳米药物的开发经验不丰富.在诸多影响因素中，紫杉醇/白蛋白摩尔比会对纳米颗粒的粒径、释放性能和稳定性等有重要影响.因此，本文通过注入法制备不同摩尔比的紫杉醇白蛋白纳米粒，测定不同摩尔比紫杉醇白蛋白纳米粒的粒径，并通过绘制紫杉醇紫外标准曲线确定不同摩尔比紫杉醇白蛋白纳米粒的体外释放，从所测粒径结果和释放结果分析合适摩尔比.最后考察了9∶1摩尔比紫杉醇白蛋白纳米粒的稳定性.所得结果将为开发紫杉醇白蛋白纳米粒产品提供重要理论依据.

1 实验部分

1.1 实验仪器

电子天平(METTLER TOLEDO AL204梅特勒-托利多仪器有限公司，上海，中国，测量精度为±0.01 mg)；Benchtop pro 31冷冻干燥机(VirTis公司，美国)；Zetasizernano ZS 型粒度仪/电位仪(Malvern Instruments公司，英国)；SHA-B水浴恒温振荡器(金坛国旺实验仪器厂，常州，中国)；78HW(1型恒温磁力搅拌(泰斯特仪器有限公司有限公司，天津，中国)；D-3L型高压均质机(Ph-Tech公司，美国)

图1 紫杉醇(A)与牛血清白蛋白(B)的结构

1.2 实验试剂

磷酸二氢钠(ACS级试剂，北京百灵威科技有限公司)；磷酸氢钠(分析纯AR，纯度(≥99%，ACROS Organics)；十二烷基硫酸钠(分析纯AR，天津科密欧化学试剂有限公司)；丙酮(纯度(≥99.7%，分析纯AR，天津科密欧化学试剂有限公司)；甲醇(纯度(≥99.7%，分析纯AR，天津科密欧化学试剂有限公司)；紫杉醇(购于阿拉丁有限公司)：牛血清白蛋白(分子量=68 000，购于中国北京百灵威有限公司)；实验室溶剂配置用水均为三次去离子水.

1.3实验步骤

1.3.1 紫杉醇紫外标准曲线的绘制.用分析天平准确称取紫杉醇适量，加甲醇溶解，配制成75 μg/mL紫杉醇储备液.分别准确吸取一定量的紫杉醇储备液于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释到刻度.配制成浓度为0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、 5 μg/mL、8 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL的紫杉醇溶液.对25 μg/mL的紫杉醇溶液，用紫外扫一个全波长.将配好的溶液按低浓度到高浓度依次在最大吸收波长处测量紫外吸收，记录227 nm下的吸收度(227 nm为最大吸收波长)，将其浓度和吸光度进行回归，得到标准曲线.

1.3.2 不同摩尔比紫杉醇白蛋白纳米粒的制备及粒径测定.采用注入法制备紫杉醇白蛋白纳米粒[8,9].5 mg紫杉醇溶于1 mL丙酮，取一定量白蛋白溶于10 mL水，药载比(药物/白蛋白摩尔比)设为7∶1，9∶1及11∶1，搅拌条件下将紫杉醇丙酮溶液逐滴加入白蛋白水溶液中，继续搅拌5 min后，旋蒸除去丙酮，加水定容至10 mL后，高压均质即得紫杉醇/白蛋白纳米粒(PTX/BSA NPs)溶液.马尔文粒度仪测定其粒径，采用 4 mW He-Ne激光器，波长633 nm，散射角为173°.

1.3.3 不同摩尔比紫杉醇白蛋白纳米粒的体外释放.用移液枪分别吸取上述纳米粒溶液2 mL置于透析袋(MW=8 000-14 000)中，释放外液选择pH=7.4的PBS(含0.5% SDS)，每隔一定时间取样3 mL，并补同等体积空白释放外液，吸取出来样品在227 nm处测得紫外的吸光度，将吸光度代入紫杉醇标准曲线中得到药物浓度.然后计算释放的百分比，并且绘制出释放曲线.

1.3.4 9:1摩尔比紫杉醇白蛋白纳米粒的稳定性考察及载药量的测定.取9:1摩尔比的紫杉醇白蛋白纳米粒在4℃的冰箱中避光放置一周后，用马尔文粒度仪测量粒径确定稳定性.将2 mL纳米粒溶液冻干后，重溶于1 mL有机溶剂中(甲醇)，涡旋1 min，使蛋白变性沉淀，10 000 rpm离心10 min弃去蛋白沉淀，上清液用甲醇适当稀释后，在波长为227 nm下进行紫外吸光度的测量，得到药物浓度，按以下公式计算载药量

其中W1为冻干纳米粒中的药物质量，W2为冻干纳米粒的总质量.

2 结果与讨论

2.1 紫杉醇紫外标准曲线的测量结果

图2 紫杉醇紫外标准曲线

由紫杉醇的紫外全波长扫描图可知，其最大吸光度对应的波长为227 nm.

以紫杉醇浓度为横坐标，波长227 nm处的吸光度为纵坐标，得到线性回归方程：Y=0.036 9X+0.00 08R2=0.999 8，在0.5-25 μg/mL的浓度范围内拟合性良好，得到紫杉醇的标准曲线如图2所示.

2.2 紫杉醇白蛋白纳米粒制备工艺的确立

纳米颗粒的大小直接影响药物的释放、生物利用度、载药量与靶向性等，是衡量纳米制剂质量的重要指标.影响粒径和分布的因素包括处方配比、制备工艺和分散设备等.许多研究表明高压均质机制备的纳米颗粒粒径较小，且粒度分布均匀和稳定性好[10,11].为考察高压均质次数对紫杉醇白蛋白纳米粒粒径的影响，制备摩尔比9∶1的紫杉醇白蛋白纳米粒并进行高压均质.

由于高压均质时间过长会导致样品温度升高，所以每次高压均质的时间控制为1.5 min.接下来通过每高压均质一次测一次粒径的方法确定高压均质的次数.其粒径分布的变化情况如图3-图6所示

图3 摩尔比9∶1未均质时的粒径及其分布

图4 摩尔比9∶1均质一次时的粒径及其分布

由图3-图6可以看出，高压均质三次时的粒径范围在10-200 nm且分布均匀，故确定高压均质的次数为3次.

2.3 紫杉醇/白蛋白纳米粒(PTX/BSA NPs)的粒径及其分布

目前测量纳米颗粒尺寸的仪器主要有透射电镜、X射线衍射仪、激光粒度仪等，其中激光粒度仪不仅可以测得粒径大小，还可以给出粒径分布[12,13].不同药载比的紫杉醇/白蛋白纳米粒(PTX/BSA NPs)粒径、PDI值见表1，粒径分布见图7-图9.

图5 摩尔比9∶1均质二次时的粒径及其分布

图6 摩尔比9∶1均质三次时的粒径及其分布

图7 药载比7∶1 PTX/BSA NPs的粒径分布图

图8 药载比9∶1 PTX/BSA NPs的粒径分布图

图9 药载比11∶1 PTX/BSA NPs的粒径分布图

图10 紫杉醇/白蛋白纳米粒(PTX/BSA NPs )的释放曲线

表1 不同药载比的PTX/BSA NPs的粒径及PDI值

PTX/BSA药载比Size/nmPDI7∶1169.1±2.00.175±0.0119∶1144.6±1.50.200±0.00911∶1158.8±2.20.209±0.014

从所测粒径结果可以看出，不同药载比的紫杉醇/白蛋白纳米粒(PTX/BSA NPs)的粒径有所差异(7∶1与9∶1组间P值=0.001；11∶1与9∶1组间P值=0.000，均小于0.01，差异显著)，不难发现药载比为9∶1制备的紫杉醇白蛋白纳米粒的粒径是最小的，且从粒径分布图上看，药载比从7∶1增加至11∶1的过程中，小部分纳米粒开始聚集，逐渐形成大颗粒(图中箭头所示).

2.4 紫杉醇/白蛋白纳米粒(PTX/BSA NPs)的释放曲线

紫杉醇/白蛋白纳米粒(PTX/BSA NPs)的释放曲线如图10所示.

从释放结果可以看出，不同药载比的紫杉醇/白蛋白纳米粒(PTX/BSA NPs)的释放稍有差异(7∶1与9∶1在24 h释放度组间P值=0.004；11∶1与9∶1组间P值=0.406，前者小于0.05，差异显著)(7∶1与9∶1在72 h释放度组间P值=0.003；11∶1与9∶1组间P值=0.021，均小于0.05，差异显著)，以9∶1制备的纳米粒释放速率最慢，有较好的缓释效果.

2.5 9∶1摩尔比紫杉醇白蛋白纳米粒的稳定性及载药量

图11 摩尔比9∶1放置一周的粒径及其分布

将样品在4℃冰箱中放置在一周验证其稳定性.放置一周的粒径图如图11所示.

由上图可知放置一周的NPs粒径几乎没有改变，并且分布均匀.所以制备的NPs在放置一周后粒径不发生改变，稳定性较好.

制备的纳米颗粒中紫杉醇的载药量为紫杉醇质量与纳米颗粒质量之比，经计算，载药量为11.45%.

3 结论

本文通过紫外可见光谱确定紫杉醇的最大吸收波长为227 nm，从所测粒径结果可以看出，不同药载比的紫杉醇/白蛋白纳米粒(PTX/BSA NPs)的粒径有所差异，按照9∶1摩尔比制备的纳米粒的粒径最小，药载比从7∶1增加至11∶1的过程中，小部分纳米粒开始聚集，逐渐形成大颗粒.从释放结果可以看出，不同药载比紫杉醇/白蛋白纳米(PTX/BSA NPs)的释放稍有差异，9∶1制备的纳米粒释放速率最慢.紫杉醇/白蛋白摩尔比9∶1制备的PTX/BSA NPs在粒径及释放行为上均显示出了稍许优势.以9∶1制备的纳米粒载药量为11.45%，且放置一周后粒径不发生改变，证明稳定性较好.

[1] 季秀峰, 石莉, 邓意辉. 白蛋白纳米粒药物传递系统的研究进展[J]. 沈阳药科大学学报, 2010, 27(12):968-978.

[2] Marupudi N I, Han J E, Li K W, et al. Paclitaxel: a review of adverse toxicities and novel delivery strategies [J]. Expert Opinion on Drug Safety, 2007, 6(5):609-621.

[3] 王铁威, 吴雁, 李明军,等. 紫杉醇纳米粒的制备和释药性能研究[J]. 中药材, 2009, 32(9):144 7-144 9.

[4] 宋祖荣, 贾晓益, 陈玲.紫杉醇纳米递药系统研究进展[J]. 长江大学学报:自科版, 2016, 13(36):76-80.

[5] 蒋琦纬. 紫杉醇纳米粒子的自组装及表征[D]. 厦门：厦门大学, 2012.

[6] 金晓慧.叶酸介导紫杉醇-白蛋白纳米粒的制备、质量评价及冷冻干燥工艺的研究[D].哈尔滨：东北林业大学,2013.

[7] 高原, 于洪儒, 王洪新. 紫杉醇白蛋白片段纳米粒的制备[J]. 重庆医科大学学报, 2012, 37(9):795-798.

[8] 高飞，王东凯，张春叶,等. 乙醇注入法制备水飞蓟宾脂质体及其质量评价[J]. 中国药剂学杂志, 2008, 6(6):301-308.

[9] 张晓丽，吴品昌，刘宇,等.乙醇注入法制备莪术醇脂质体[J].中国实验方剂学杂志, 2012, 18(4):10-12.

[10] 艾秀娟, 陈建海, 平渊,等. 高压均质技术在纳米制剂制备中的应用[J]. 医药导报,2007,26(9):105 5-105 8.

[11] RamonB R,MangerS. Factors involved in the production ofliposomeswith a highpressure homogenizer[J]. Inter J Phar,2001,213 (1):175-186.

[12] 吕凤娇, 林华香, 陈晓耕,等. 激光粒度仪测定阿霉素纳米颗粒的粒径及粒径分布[J]. 福州大学学报, 2006, 34(5):751-754.

[13] Fang R, Hao R, Wu X, et al. Bovine serum albumin nanoparticle promotes the stability of quercetin in simulated intestinal fluid[J]. J Agric Food Chem, 2011, 59(11):629 2-629 8.

The Study on the Preparation and Drug Release Properties of Paclitaxel Albumin Nanoparticles with Different Drug/Carrier Ratio

CAI Chang ZHAO Yan-na LIU Min

(Institute of Bio Pharmaceutical Research,Liaocheng University,Liaocheng 252059,China)

Paclitaxel, an effective drug for the treatment of cancer, has a strong anti-cancer effect and broad-spectrum treatment. Paclitaxel albumin nanoparticles can increase their solubility and bioavailability. In this paper, paclitaxel albumin nanoparticles with different drug / carrier ratio (paclitaxel / bovine serum albumin) were preparedby Injection method.The particle size and drug release properties of the prepared paclitaxel nanoparticles were investigated.The nanoparticles prepared with paclitaxel / bovine serum albumin ratio of 9∶1 had the smallest and most uniform particle size, as well as the slowest release rate, which indicated that the resulting nanoparticle had better sustained release effect.After being placed for one week, the particle size of the nanoparticle did not change significantly, which indicated that the particle was stable. The drug loading was calculated to be 11.45%.

paclitaxel，bovine serum albumin，nanoparticles，drug/carrier ratio，drug release，stability

2017-02-26

国家自然科学基金项目(21473085)；山东省重点科研开发项目(2015GGB01567)资助

刘敏，E-mail:liumin2@lcu.edu.cn.

R943

A

1672-6634(2017)02-0050-06