探针药物法评价奥拉西坦对大鼠体内CYP3A酶活性的影响

刘宏达 任静华 谭显惠 吕增禄 王淑梅

摘要：目的：研究奥拉西坦连续多次灌胃给药对大鼠CYP3A酶活性的影响。方法：40只SD大鼠随机分为2组，实验组大鼠每天一次奥拉西坦（200mg·kg-1）灌胃，对照组每天1次蒸馏水灌胃（1.5mL）；连续5日，于第6日，2组大鼠均单剂量尾静脉注射咪达唑仑10mg·kg-1，后由眼底靜脉丛取血，高效液相色谱法测定血药浓度，以DAS 2.1.1 药物动力学程序拟合药动学参数，以SPSS18.0 软件对组间各参数进行统计分析。结果：咪达唑仑标准曲线方程为：Y=0.0752X-0.0042（r=0.9999），线性范围为0.1-30mg·L-1；；方法回收率高中、低浓度分别为（104.9±4.30）%、（101.6±3.28）%和；（109.8±4.54）%，对照组与实验组主要药动学参数：t1/2、Cmax、AUC0-12h无显著性差异。结论：合用奥拉西坦前后，咪达唑仑在大鼠体内主要药动学参数无明显变化，提示奥拉西坦对大鼠体内CYP3A4无影响。

促智药奥拉西坦（oxiracetam，ORC）具有很好的改善记忆和学习功能，临床常用于理化因素所致脑缺氧、慢性脑功能不全及智能、记忆力障碍等的治疗[1]。奥拉西坦对对肝微粒体酶影响研究尚少，其代谢途径尚不清晰。本研究将咪达唑仑作为探针药物[2]，探讨奥拉西坦对CYP3A 酶活性的影响[3-4]，为与其他临床药物联合用药合理性提供参考依据。

关键词：奥拉西坦；咪达唑仑；CYP3A4；高效液相色谱法；药动学

1 仪器与材料

1 仪器与材料

1.1 仪器

Diamonsil C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm，美国Waters公司）；涡旋混合器（XW-80A，上海医科大学仪器厂）；冷冻离心机（GL-20G-Ⅱ，上海安亭科学仪器厂）；高效液相色谱系统。

1.2试验用药

乙腈（天津市康科德科技有限公司，批号：111203）。奥拉西坦对照品（中诺药业有限公司-石药集团，纯度99.60%，批号：128101207）；咪达唑仑对照品（宜昌人福药业责任有限公司，含量100.8%，批号MD111106）；咪达唑仑注射液（规格5ml：5mg，江苏恩华药业集团有限公司，批号20110825）注射用奥拉西坦（规格1.0g，批号262120318）石药集团欧意药业有限公司，

1.3 实验动物

雄性SD大鼠，清洁级，体重（300±10）g，动物许可证号SCXK（晋）2009-0001，由山西省动物实验中心提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Diamonsil C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-水（62：38，V/V）；进样量：20μL，柱温：30℃；检测波长：225nm；流速：1.0mL·min-1。

2.2 血浆样品处理

室温下自然解冻血浆样品，以10000r·min-1速度离心5min后取200μL上清液于塞离心管中，加入20μl内标溶液混匀后（150μg/ml地西泮溶液为内标液），加提取剂（异丙醇：乙酸乙酯=2：8）500μl，涡旋震荡1min，10000rpm离心5min，取上清液500μl，37℃水浴下氮气流吹干，残渣用100μl甲醇复溶后进样处理。

2.3 方法学

2.3.1专属性试验

取咪达唑仑和内标地西泮对照品溶液进样。然后取空白血浆及灌胃后给咪达唑仑的血浆样品进样处理、测定并记录色谱图。结果提示我们在相应色谱条件下，咪达唑仑保留时间为6.7min。且峰形良好，内标保留时间为8.2min峰形良好，，咪达唑仑的测定未受大鼠血浆中内源性物质干扰。见图1.

2.3.2 标准曲线

按“2.1.2”项下方法，将浓度分别为30，20，10，5，1，0.25，0.1，μg /ml的咪达唑仑模拟血浆样品，进行处理测定。以测得的咪达唑仑峰面积与内标的峰面积之比（Y）对血浆药物浓度（X）进行线性回归，得到标准曲线方程为Y=0.0752X-0.0042（r=0.9999，n=7），在0.1～30mg·L-1浓度范围内具有良好的线性关系。。

2.3.3 回收率

咪达唑仑及内标提取回收率：将空白血浆15份，分为3组，每组5份，分别制备20μg/ml、5μg/ml、0.25μg/ml的咪达唑仑模拟血浆样品，按照2.2血浆样品处理进行测定并记录峰面积值。咪达唑仑提取回收率计算为咪达唑仑峰面积与直接进样的对照品溶液峰面积比值；内标提取回收率为地西泮峰面积与直接进样的对照品溶液峰面积比值。

方法回收率：将空白血浆15份，分为3组，每组5份，分别制备20μg/ml 、5μg/ml、0.25μg/ml的咪达唑仑模拟血浆样品，依照上面2.2血浆样品处理方法测定后记峰面积数值。方法回收率为计算测得浓度与加入浓度的比值。

2.3.4精密度

取空白血浆15份，分3组，每组5份，依次制备20μg/ml0、 5μg/ml、25μg/ml的咪达唑仑模拟血浆样品，同样依照2.2血浆样品处理方法处理，并在一天的不同时间段测定，计算日内精密度；于0，1，2，3，4日处理并测定，计算日间精密度。模拟血浆样品三种不同浓度的日内精密度、日间精密度的RSD值分别为6.38%，3.23%、11.05%、均在规定范围内，表明该方法精密度良好。

2.3.5稳定性试验

根据需要，分别考察了样品室温放置的稳定性，长期冷冻保存稳定和反复冻融稳定性。结果表明：室温下阴暗干燥处放置4h，-40℃低温避光保存10d，反复冻融3 次，RSD< 6.4%，能够很好的满足血清样品测定的需要。

2.4药动学实验

2.4.1溶液的制备

浓度为10mg·L-1咪达唑仑原液即用。另将奥拉西坦注射液2支，注入50ml量瓶中，用蒸馏水定容，然后制备成为40mg·L-1浓度的奥拉西坦溶液。

2.4.2分组与给药

40只健康SD大鼠备随机分成2组，每组20只，设为对照组和实验组。对照组每天一次1.5mL蒸馏水灌胃；实验组每天一次奥拉西坦溶液灌胃（200mg·kg-1），连续5天达稳态后，两组大鼠均以10mg·kg-1的比值尾静脉注射咪达唑仑。并分别以给药后0min，5min，10min，20min，30min，1h，1.5h，2h，4h，6h为时间点眼内眦取血，每次取血0.5mL，置于肝素钠抗凝的离心管中，以10000r·min-1的速度离心5min，取上层血浆，保存在-40℃冰箱待测。

2.4.3血样测定与数据处理

将自然解冻的待测SD大鼠血浆样品，按照2.2血浆样品处理方法进行处理，测定数值。按照标准曲线方程对每只动物各个时间点的血浆药物浓度进行计算，将血药浓度-时间数据用DAS2.1.1药代动力学软件处理，得到对照组与实验组大鼠的药动学参数，使用SPSS13.1统计学软件进行计算，比较两组间参数差异有无统计学意义。两组大鼠体内咪达唑仑的药-时曲线见圖2，主要药物参数见表2

计学处理，结果显示，与对照组比较，实验组的t1/2、Cmax、AUC（0-12）、AUC（0-∞）、CL/F和V/F与对照组相比没有显著性差异（P>0.05）。

3讨论

文献报道[5]，观察被影响药物体内药动学的变化情况，先给予能够产生影响的药物，使其体内达到稳态水平。对肝微粒体酶系统的影响充分体现出来，再给予被影响药物。奥拉西坦使用后，在脑、肝、肾、及皮肤等全身组织药物广泛分布，3-5天可达稳态；在研究奥拉西坦对咪达唑仑的相互作用时，首先应确保体内是否达到稳态。而后尾静脉给予咪达唑仑注射，密切观察其药动学变化情况，如实反映奥拉西坦对咪达唑仑药动学的影响。

参考文献：

[1]纪立伟，胡欣，促智药奥拉西坦研究进展[J ].中国药物与临床，2003，3（4）：354-356.

[2]赵娜萍，余露山，HPLC法测定大鼠血浆中咪达唑仑的含量及其在药物相互作用研究中的应用[J].药物分析杂志，2007，（6）465-467

[3]刘昌孝，顾以保，李全胜等，奥拉西坦在大鼠和小鼠的药代动力学研究[J]药学学报，1999，34（2）：85.

[4]刘秀菊，张志清，杨秀岭等.HPLC法测定大鼠血浆中奥拉西坦的浓度[J].中国药房，2012.23.（5）：403

[5]Linda E G，Jeanette F K，Anthony L E，et al. Effect of omeprazole on concentrations of clarithromycin in plasma and gastric tissue at steady state[J]. Antimicrobial agents and chemotherapy，1995，39（9）：2078-2083.