无乳链球菌荚膜多糖的粗提及多糖含量测定条件优化

张 哲，杨 峰，李新圃，罗金印，刘龙海，李宏胜*

(1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/农业部兽用药物创制重点室/甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃兰州 730050；2.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 730070)



无乳链球菌荚膜多糖的粗提及多糖含量测定条件优化

张 哲1,2，杨 峰1，李新圃1，罗金印1，刘龙海1，李宏胜1*

(1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/农业部兽用药物创制重点室/甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃兰州 730050；2.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 730070)

为提取无乳链球菌荚膜多糖，并对苯酚-硫酸法测定多糖含量条件进行优化。离心收集发酵上清液，超滤浓缩，经800 mL/L乙醇沉淀提取无乳链球菌荚膜多糖；采用单因素试验对苯酚硫酸法测定条件进行优化，并对测定方法的可靠性进行验证。结果表明，从1 L发酵液中提取到含量为38.51%的荚膜多糖0.36 g；测定的最佳条件为：2 mL样品液中，加入1 mL 50 mL/L的苯酚，5 mL浓硫酸，混匀后80 ℃作用20 min，在1.5 h内测定485 nm处的光密度。在该条件下，平均加样回收率为99.96%，相对标准偏差为0.40%。说明从无乳链球菌发酵上清液中成功提取到荚膜多糖，建立了苯酚硫酸法测定荚膜多糖的最优条件。

无乳链球菌；荚膜多糖；苯酚-硫酸法

无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)为革兰阳性球菌，于1887年在患乳腺炎的牛中被首次分离而得名,属于Lancefield血清学分类中的B群，因此在人医临床上又被称为B群/族链球菌(Group BStreptococcus,GBS)[1-2]。GBS可引起新生儿脑膜炎、肺炎及败血症等，对老人、孕妇等其他免疫功能低下的人群是一个潜在的威胁，还可感染猪、牛及鱼等多种动物[3-4]。此外，部分血清型的牛源、鱼源及人源GBS能够交叉感染，对人类的健康构成了巨大的威胁[5]。在GBS感染机体的过程中，荚膜多糖、β-溶血素及CAMP因子等毒力因子起着重要作用[6]。其中，荚膜多糖是一种存在于细菌细胞壁外，由cps A基因编码的富含唾液酸的多糖，有助于细菌黏附于宿主细胞表面，保护细菌免受抑菌或杀菌物质的侵害以及宿主吞噬细胞的吞噬，是GBS最重要的毒力因子[7]。同时，荚膜多糖还是细菌结构变化最少的表面抗原之一，具有良好的免疫原性，是最适宜做疫苗的靶抗原之一[8-9]。为提高疫苗的免疫效果，一般要对提取的荚膜多糖进行纯化，而多糖含量的测定，是检测多糖纯度的重要手段[10]。

本研究拟采用乙醇沉淀法从GBS发酵液中提取荚膜多糖，并对苯酚-硫酸法测定荚膜多糖含量的试验条件(如测定波长、苯酚用量及显色温度等)进行优化，旨在探究荚膜多糖含量测定的最佳条件，为荚膜多糖的提取、纯化研究及荚膜多糖疫苗的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 无乳链球菌(M19)，为本实验室前期从奶牛乳房炎奶样中分离、鉴定并冻存的菌种。

1.1.2 培养基 血琼脂基础培养基(批号：3102396)、营养琼脂(批号：3101694)、营养肉汤(批号：3102303)，为广东环凯微生物科技有限公司产品；THB液体培养基为本实验室配置，并添加有10 g/L的葡萄糖。

1.1.3 主要仪器 紫外可见分光光度计，水浴锅，全温振荡培养箱，10kD超滤膜包(Sartorius)，离心机和冻干机等。

1.2 方法

1.2.1 GBS荚膜多糖的粗提和多糖样品液的制备 将冻存的无乳链球菌M19菌种接种到琼脂平板上，复苏3代后接种到营养肉汤，37 ℃培养12 h，经涂片镜检纯粹后，以1%的接种量分别接种于THB液体培养基中发酵培养10 h(37 ℃、120 r/min)。期间每隔2 h，用灭菌NaOH溶液(2 mol/L)调节发酵液的酸碱度，保持pH在7.2左右。

将培养好的发酵液离心收集上清(4℃，4 000 r/min，20 min)，并用0.22 μm滤膜过滤除菌，滤过液经10 kD的超流滤设备浓缩10倍，向浓缩液中加入无菌蒸馏水至原体积，再次超滤浓缩，如此重复3次；在浓缩液中加入至终体积比为250 mL/L的无水乙醇，4 ℃作用12 h后离心去除沉淀，收集上清液；往上清液中加入无水乙醇至终体积变为800 mL/L，混匀后4 ℃静置24 h，4 ℃离心1 h，收集多糖沉淀；用无水乙醇及丙酮各洗涤两次，真空冷冻干燥，即得粗提荚膜多糖制品。

精密量取冻干多糖样品100 mg，蒸馏水定容至100 mL；取上述溶液20 mL，再次用蒸馏水定容至100 mL，即为0.2 mg/mL样品液。

1.2.2 显色条件优化

1.2.2.1 最佳测定波长的确定 分别吸取1 mL葡萄糖标准液(0.1 mg/mL)和多糖样品液(0.2 mg/mL)，蒸馏水补足至2 mL，并以2 mL蒸馏水做空白对照，再分别加入5%的苯酚0.5 mL和浓硫酸5 mL，混合均匀后，沸水浴显色10 min，在400 nm～600 nm波长范围扫描，确定最佳测定波长。

1.2.2.2 单因素试验 影响苯酚-硫酸法测定结果的主要因素有显色温度、显色时间、苯酚用量及硫酸用量。因此，本试验在不同的显色温度(4、30、60、80、100 ℃)、显色时间(0、10、20、30、60 min)、苯酚用量(0.5、1、1.5、2 mL)及硫酸用量(3、4、5、6、7 mL)的条件下，分别进行单因素试验，测定光密度。

1.2.3 标准曲线的绘制 取0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mL葡萄糖标准液，以蒸馏水补足至2 mL，按1.2.2.1中优化后条件测定光密度。即依次加入1 mL 50 mL/L的苯酚，5 mL浓硫酸，混匀，80 ℃作用20 min后测定485 nm处的光密度。以葡萄糖浓度(C)为横坐标,光密度值(OD)为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.4 方法学考察 为检测该试验建立荚膜多糖测定方法的准确性及可靠性，参照文献[11]，对该方法的精密度、稳定性及加样回收率分别进行了测定，并计算相对标准偏差(RSD)。1.2.5 多糖含量的测定 取制备好的多糖样品液1 mL，加水补至2 ml，以2 ml蒸馏水做空白对照，按1.2.2.2中所述方法测定样品液的光密度(做3个重复，取平均值)，代入标准曲线方程计算多糖浓度，并按照下述公式[12]计算样品中的荚膜多糖的含量。

多糖含量(%)=0.9×C×D/m，其中C为样品液中单糖浓度，D为样品液的稀释倍数，m为样品液中多糖质量，0.9为葡萄糖换算成多糖的校正系数。

2 结果

2.1 GBS荚膜多糖的粗提

1 LGBS发酵液经处理后，真空冻干得到0.36 g粗提荚膜多糖。

2.2 最佳测定波长的选择

以蒸馏水为空白对照，葡萄糖标准液及多糖样品液经显色处理后，在400 nm～600 nm波长范围扫描结果如图1所示。对图谱进行综合分析，选定最佳测定波长为485 nm。

图1 最佳测定波长的选择

2.3 单因素试验

2.3.1 显色温度 吸取1 mL多糖样品液，加蒸馏

水补足至2 mL，并以2 mL蒸馏水做空白对照，再分别加入50 g/L的苯酚0.5 mL和浓硫酸5 mL，混合均匀后分别于4、30、60、80、100 ℃显色10 min，测定OD值。结果如图2A所示，80 ℃为最佳显色温度。

2.3.2 显色时间 吸取1 mL多糖样品液，加蒸馏水补足至2 mL，并以2 mL蒸馏水做空白对照，再分别加入50 g/L的苯酚0.5 mL和浓硫酸5 mL，混合均匀后于80 ℃情况下显色0、10、20、30 min后，测定OD值。结果如图2B所示，20 min为最佳显色时间。

2.3.3 苯酚用量 吸取1 mL多糖样品液，加蒸馏水补足至2 mL，并以2 mL蒸馏水做空白对照，再分别加入50 g/L的苯酚0.5、1、1.5、2 mL和浓硫酸5 mL，混合均匀后于80℃情况下显色20 min，测定OD值。结果如图2C所示，1 mL为最佳苯酚用量。

2.3.4 硫酸用量 吸取1 mL多糖样品液，加蒸馏水补足至2 mL 并以2 mL蒸馏水做空白对照，再分别加入50 g/L的苯酚1 mL和浓硫酸3、4、5、6、7 mL，混合均匀后于80 ℃情况下显色20 min，测定OD值。结果如图2D所示，5 mL为最佳硫酸用量。

A.温度；B.时间；C.苯酚;D.硫酸A.Temperature;B.Time;C.Phenol;D.Sulfuric acid

2.4 标准曲线的绘制

以葡萄糖浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线(图3)，求得回归方程为：OD=13.435*C-0.040 91(其中，OD为光密度值，C为多糖浓度)，相关系数R2=0.999 58。表明葡萄糖浓度在0.01 mg/mL～0.08 mg/mL范围内，线性关系良好。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 取多糖样品液1 mL，按1.2.2.2所述操作处理，连续测定6次，光密度分别为0.531、0.540、0.535、0.541、0.531、0.536，RSD=0.798%(n=6)。

图3 葡萄糖标准曲线

2.5.2 重复性试验 精密称取6份冻干多糖样品各20 mg，分别用蒸馏水定容至100 mL，得0.2 mg/mL样品液。各取样品液1 mL，按1.4所述操作处理，测得光密度值为0.491、0.529、0.503、0.526、0.541、0.495，RSD=3.994%(n=6)。

2.5.3 稳定性 取多糖样品液1 mL，按1.2.2.2所述操作处理，并于第0、10、20、30、60、90 min测定光密度，测得光密度值分别为0.529、0.530、0.528、0.531、0.531、0.529，RSD=0.229%(n=6)。

2.5.4 加样回收率 取1 mL多糖样品液6份，分别加入葡萄糖标准液各1 mL，按1./2.2.2所述操作进行处理并测定光密度，计算加样回收率(表1)。由表1可知，平均相对标准偏差RSD=0.401% (n=6)，平均加样回收率为99.96%。

表1 多糖加样回收率

2.6 荚膜多糖含量测定

测得样品液光密度为0.534，代入回归方程，求得单糖含量为0.0428 mg/mL，带入多糖含量计算公式，得出多糖含量为38.51%。

3 讨论

荚膜多糖是GBS生长过程中合成的一种胞外多糖，常附着与菌体的细胞壁上，在振荡培养或离心的条件下，往往从菌体脱离，释放到发酵液中。因此，本试验采用成本低，处理量大的有机溶剂(乙醇)沉淀法，从GBS发酵上清液中提取荚膜多糖。最终，从1 L发酵上清液中，提取到含量为38.51%的粗提荚膜多糖0.36 g。杨育芳[12]曾采用相同的方法，从人源GBS发酵液中提取荚膜多糖，并对多糖进行纯化，最终得率为0.021 g/L～0.027 g/L。然而，文中未对粗糖得率进行说明，本试验提取的粗糖精制后的得率能有多少，还需进一步的试验验证。

多糖物质的含糖量测定，一直是多糖研究中的一个重要问题。目前，对于多糖的测定，主要有比色法(苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等)、滴定法(间接碘量法)、高效液相色谱法、薄层扫描法及高效毛细管电泳法等。在上述几种方法中以比色法(苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法)最为常用[13]，该类方法是利用多糖在浓硫酸的作用下水解生成的单糖迅速脱水变为糖醛衍生物，后者再与苯酚或蒽酮缩合成的有色化合物，在一定范围内，其光密度与糖浓度呈线性相关，来测定样品中多糖的含量。因不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因单糖类种类的不同造成误差。相比而言，苯酚-硫酸法具有试验操作步骤少，稳定性好及所用仪器简单等优势被广泛用于测定多糖含量[14]。

特别需要注意的是在苯酚-硫酸法测定多糖样品时，应对样品进行预处理，以消除样品中原有单糖的干扰。为此，本试验采用10 kD超滤膜，经3次超滤去除液体培养基中原有的单糖。此外，在测得单糖含量后，计算多糖含量时，需乘以多糖换算因子(f=W/m，其中W为称取多糖的质量，m为测得单糖的质量)。多糖水解为单糖时吸收了部分水。因此，从理论上来说，换算因子f应该小于1。然而，邸明磊等[15]测得苦豆子多糖的换算因子为1.22，南瓜籽多糖的换算因子更是达到了10.75[16]。这可能是因为待测多糖中含有较多的杂质，使得检测结果偏高。由于我们尚未对提取的粗糖进行纯化，也未能购买到相应的纯品，本试验没有对多糖的转换因子进行测定，而采用文献[12]报道的0.9作为GBS荚膜多糖的转换因子。

本试验对无乳链球菌M19进行发酵培养，离心收集上清液，10 kD超滤膜超滤浓缩，用乙醇沉淀多糖，经真空冻干，从1 L发酵液中提取到含量为38.51%的GBS荚膜多糖0.36 g。表明该方法可行，为荚膜多糖疫苗的研究奠定了基础。已报到的大部分文献在使用苯酚-硫酸法测定多糖含量时，多采用沸水浴加热，并在490 nm处测定光密度，经过我们的优化，最终确定测定荚膜多糖的最佳操作条件为：在2 mL待测样品液中，依次加入1 mL 5 g/L苯酚，5 mL浓硫酸，混匀后80 ℃作用20 min，在1.5 h内测定485 nm处的光密度。通过测定该方法的精密度(RSD=0.798%)、重复性(RSD=3.994%)、稳定性(RSD=0.229%)及加样回收率(99.37%～100.56%，RSD=0.401%)，表明该方法操作简单，快速、准确，条件易于掌握，所需仪器、药品价格低廉，可以在常规试验条件实施，适用于荚膜多糖含量的测定，具有一定的参考与推广价值。

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Optimization for Extraction and Content Determination of Capsular Polysaccharide fromStreptococcusagalactiae

ZHANG Zhe1,2，YANG Feng1，LI Xin-pu1，LUO Jin-yin1，LIU long-hai1，LI Hong-sheng1

(1.KeyLaboratoryofNewAnimalDrugProjectofGansuProvince,KeyLaboratoryofVeterinaryPharmaceuticalDiscovery，MinistryofAgriculture,LanzhouInstituteofAnimalHusbandryandPharmaceuticalSciences，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Lanzhou,Gansu,730050,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,Gansu,730070,China)

This study was aimed to isolate capsular polysaccharide fromStreptococcusagalactiae,and to establish optimal conditions for determination of capsular polysaccharide (CP).Bacterial cells were removed by centrifugation,and the culture fluid was concentrated over ultrafiltration system.Crude CP was precipitated by bringing the solution to a concentration of 800 gL/L ethanol.Single factor test was preformed to investigate optimal conditions of phenol-sulfuric acid method,and reliability of the method was also evaluated.The results showed that 0.36 g crude polysaccharide was isolated from one liter broth ofS.agalactiae,and the polysaccharide content was 38.51%.The optimal conditions for determination of CP was established:add 1 mL 50 mL/L phenol solution into 2 mL polysaccharide solution; then 5 mL sulfuric acid was added,and incubated for 20 min at 80 ℃; All tubes were allowed to cool down to room temperature before reading the absorbances at 485 nm.Under the optimal conditions,the average recoveries of the method was 99.96%,the relative standard deviation was 0.40%.S.agalactiaeCP was isolated from culture supernatant,and the optimal conditions for determination of CP was established.

Streptococcusagalactiae; capsular polysaccharide; phenol-sulfuric acid method

2016-11-01

“十三五”国家重点研发项目(2017YFD0502201)；甘肃省科技支撑计划项目(144NKCA240)；甘肃省农业科技创新项目(GNCX-2013-59)；中国农业科学院奶牛疾病研究创新工程项目(CAAS-ASTIP-2014-LIHPS-03)

张 哲(1990- )，男，河南商丘人，硕士研究生，主要从事奶牛乳房炎疫苗研究。*通讯作者

Q93;S852.611

A

1007-5038(2017)07-0041-05