猪流行性腹泻病毒陕西HZ株的分离与鉴定

庞文静，付明哲，许信刚，郭抗抗，张 琪

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)



猪流行性腹泻病毒陕西HZ株的分离与鉴定

庞文静，付明哲，许信刚，郭抗抗*，张 琪*

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

从陕西省某养猪场送检的腹泻仔猪小肠内容物中分离到1株病毒，用Vero细胞盲传至8代以后出现较为稳定的CPE，经理化特性检测、TCID50测定、RT-PCR鉴定及序列比对，最终确定该分离毒株为流行性腹泻病毒(PEDV)，将其命名为PEDV HZ株。以分离株RNA为模板，经RT-PCR扩增出大小为681 bp和1 326 bp的M基因和N基因，并与其他国内外分离株的相应基因进行比较，结果显示，PEDV HZ株与其他国内外分离株的M基因和N基因核苷酸序列的同源性分别为98.1%～100%和93.9%～100%，氨基酸序列的同源性分别为96.9%～99.6%和93.0%～100%，遗传进化树分析显示，PEDV HZ株与中国株CHGD-01处于同一个进化分支，亲缘关系最近。

猪流行性腹泻病毒；分离鉴定；M基因；N基因；序列分析

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)属于冠状病毒科冠状病毒属成员，是猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)的病原[1]。PED是一种高度接触性肠道传染病，主要临床特征为厌食、体温升高、水样粪便、呕吐及脱水[1]。冬春季节是PED的高发季，各年龄段的猪均可感染，该病对1周龄以内哺乳仔猪的危害性最大，病死率可达100%；母猪和断奶猪的病死率相对较低，但部分猪恢复生长后发育不良，料肉比大幅度增加，给养殖生产造成了巨大的经济损失[2-5]，因此PED是目前养猪生产中重点防控的传染病之一。流行病学调查结果显示，近几年PED在中国各地广泛流行，成为养猪生产的防控难题[6-8]。本试验从陕西省某猪场送检的腹泻仔猪小肠内容物等样品中分离到1株病毒，并对该毒株的M基因和N基因进行序列对比，经过一系列鉴定确定分离株为PEDV，将其命名为PEDV HZ株，为PEDV进一步的研究及PED的防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料和细胞株 病料为陕西省某养猪场送检的病死仔猪出血严重的小肠及其内容物，仔猪死前主要表现为严重腹泻、粪便恶臭并且脱水严重，病料保存于-80℃备用。Vero细胞由西北农林科技大学动物医学院兽医微生物实验室保存。

1.1.2 主要试剂 新生牛血清、胰酶及DMEM基础培养液，UIBCO公司产品；DNA Marker DL 2 000、2×TaqMasterMix、Trizol Reagent，北京康为世纪生物科技有限公司产品；病毒RNA提取试剂盒(HiScript4Q RT SuperMix for qPCR)，诺唯赞生物技术有限公司产品；其他化学试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 病料处理 取冻存的腹泻仔猪小肠病料，室温解冻进行磨碎，用含1 000 IU/mL青霉素和1 000 μg/mL链霉素的PBS制成5倍悬液，反复冻融3次后，8 000 r/min 离心10 min，取上清，用孔径为0.22 μm的滤器过滤后置-80℃保存备用。

1.2.2 病毒分离培养 无菌培养Vero细胞传至10 cm培养皿中，使其长满单层且状态良好时，弃掉培养液，用PBS洗1次，将1 mL处理好的病料和5 μL的胰酶(终浓度为10 μg/mL)接种于Vero细胞，置37℃吸附1 h后，吸出接种液，加入维持液(含终浓度为10 μg/mL胰酶)培养3 d，反复冻融3次，取冻融物继续接种，定期观察CPE，盲传至出现稳定CPE,待CPE达到70%～80%时收毒置-80℃保存。

1.2.3 病毒TCID50测定 制备96孔板单层贴壁细胞；用DMEM基础培养基将1.2.2收获的病毒液按照10-1～10-10倍系列稀释；无菌操作，取出长满单层细胞的96孔板，弃除培养基，每孔用150 μL的PBS洗2次。按照稀释度的高低将病毒液从左到右依次加入96孔板中(每列一个稀释度)，11列和12列加入无血清的DMEM培养基，100 μL/孔，培养箱中孵育1 h后弃除病毒液。加入100 μL/孔的细胞维持液(含胰酶)，置37℃、体积分数为5% CO2培养箱中连续培养7 d，每天观察记录细胞孔病变情况，试验重复3次。

1.2.4 病毒核酸类型鉴定 根据药物抑制法[9]，即5溴脱氧尿嘧啶核苷(BUDR)法对病毒核酸类型进行鉴定。在细胞维持液中加入BUDR(50 mg/L)，其他步骤同1.2.3，同时设立对照组，测定2组病毒TCID50，观察BUDR存在是否影响病毒的增殖，每个试验重复3次。

1.2.5 病毒氯仿敏感性试验 用氯仿处理病毒，即在病毒液中加入氯仿(终浓度4.8%)，4℃振荡混匀10 min，3 000 r/min离心5 min后，收集上清，按常规方法接种于长满单层Vero细胞的培养瓶中，置37℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养，同时设立未经氯仿处理的病毒液作为阴性对照组，定期观察细胞病变情况。

1.2.6 引物设计与合成 根据GenBank中已发表的PEDV的M基因和N基因的序列，设计扩增针对M基因和N基因的特异性引物。M基因的上游引物F1：5′-ATGTCTAACGGTTCTATT-3′；下游引物R1：5′-CGACTAAATGAAGCAC-3′,目的片段大小为681 bp。N基因的上游引物F2：5′-ATGGCTTCTGTCAGCTTTCA-3′；下游引物R2:5′-ATTTCCTGTATCGAAGAT-3′,目的片段大小为1 326 bp。将各引物稀释至20 μmol/L，置-20℃保存备用。

1.2.7 病毒核酸提取和目的基因扩增 取200 μL盲传的病毒细胞培养液，根据Trizol Reagent说明书提取RNA。以提取的病毒RNA为模板，参照HiScript○RQ RT SuperMix for qPCR试剂盒操作说明，将病毒RNA反转录为cDNA。RT反应体系及参数：7 μL的RNA模板、1 μL的随机引物，56℃水浴5 min，冰浴2 min，加10 μL 2×RT Mix、2 μL HiScript○REnzymebMix，25℃反应5 min，50℃ 45 min,85℃ 5 min。以cDNA为模板PCR扩增M基因和N基因。PCR反应体系：10 μL 2×TaqPCR Mix，0.5 μL上、下游引物，3 μL cDNA，6 μL H2O。PCR反应参数：94℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 50 s，72℃ 50 s，35个循环；72℃ 10 min。将经以上步骤扩增获得的M基因和N基因的PCR产物送公司进行序列测定。

1.2.8 序列分析 登录NCBI GenBank，下载国内外10株PEDV毒株的M基因和N基因序列，用DNA Star软件对M基因和N基因的测序结果与该10株PEDV M基因和N基因序列进行同源性比对分析，并构建遗传进化树。10株PEDV参考毒株分别为中国株PEDV-LY(KM609210.1)、YN1-PEDV(KT021227.1)、CH-GDZQ(KM242131.1)、CHGD-01(JX261936.1)及CV777(AF353511.1)；日本株AOM-3-JPN(LC063833.1)和FKO-1-JPN( LC063811.1)；美国株USA-Minnesota236(KR265794.1)和PC177(KR078300.1)；韩国株KUIDL-PED(KJ588063.1)。

2 结果

2.1 病毒分离培养结果

将处理的病毒液接种于Vero细胞，盲传至第3代未见明显的CPE，盲传第4代以后，细胞有明显的皱缩，聚堆以及变圆等现象，盲传至第8代以后，细胞特征性病变明显，细胞呈现变圆、聚集、皱缩、出现拉网状并最终脱落等病理现象(图1)。

A.正常Vero细胞(40×)；B.接第8代毒后的Vero细胞(40×)

A.Normal Vero cells(40×); B.Vero cells inoculated with eighth generations of virus(40×)

图1 正常Vero细胞和接毒后的Vero细胞

Fig.1 Normal Vero cells and Vero cells after virus inoculation

2.2 分离毒TCID50测定

将连续10倍稀释的病毒液接种于Vero细胞，连续培养7 d后，根据细胞孔出现病变的数目(表1)，按照Reed-Muench法计算出该病毒液的TCID50=104.7/0.1 mL。

2.3 病毒核酸类型鉴定结果

按照BUDR法对该分离株的核酸类型进行鉴定，3次试验的平均结果显示，对照组的TCID50=104.7/0.1 mL，试验组的TCID50=104.42/0.1 mL。经统计学分析，试验组和对照组的差异不显著(P>0.05)，即培养液中加入BUDR后，对病毒的增殖无影响，说明该分离株为RNA病毒。

表1 细胞被不同浓度PEDV感染后CPE统计结果

2.4 病毒氯仿敏感性

试验结果显示，用氯仿处理后的病毒液接种Vero细胞后，细胞病变(CPE)不明显，而未经氯仿处理过的病毒液，接种Vero细胞后第3天细胞病变达到80%以上，说明该分离株对氯仿高度敏感，因此该病毒有囊膜。

2.5 分离株的RT-PCR鉴定结果

以提取的分离株总RNA为模板，经RT-PCR，分别扩增出到M基因和N基因，片段大小与预期结果相符，分别为681 bp和1 326 bp(图2)。说明该分离株为PEDV，将其命名为PEDV HZ株。

M.DNA 标准 DL 5 000；1.M 基因；2.N 基因；3.阴性对照

M.DNA Marker DL 5 000; 1.M gene; 2.N gene; 3.Negative control

图2 分离株M基因和N基因的扩增

Fig.2 The amplification of M and N genes of isolate

2.6 分离株M基因的序列分析

通过软件对该分离毒株M基因测序结果进行分析，显示M基因片段大小为681 bp，与预期结果相符。序列分析结果显示，PEDV HZ株与国内外其他参考毒株间有较高的同源性，核苷酸的同源性为98.1%～100%，氨基酸的同源性为96.9%～99.6%。M基因的系统遗传进化树分析结果表明(图3)，PEDV HZ株与中国株CHGD-01共处于一个分支，亲缘关系较近。

2.7 分离株N基因的序列分析

通过软件对该分离毒株N基因测序结果进行分析，结果显示，N基因片段大小为1 326 bp，与预期结果相符。序列分析结果显示，PEDV HZ株与国内外其他参考毒株有较高的同源性，核苷酸的同源性为93.9%～100%，氨基酸的同源性为93.0%～100%。N基因的系统遗传进化树分析结果表明(图4)，PEDV HZ株与中国株CHGD-01关系较近，共处于一个分支。

图3 PEDV HZ株和PEDV参考株M基因序列构建的进化树

图4 PEDV HZ株和PEDV参考株N基因序列构建的进化树

3 讨论

PEDV为单链正股RAN病毒，基因组的复制和和病毒粒子的成熟均在胞浆中进行，并且该病毒在肠系膜淋巴结和肠绒毛上皮细胞中的含量高[10-11]。PEDV的人工培养与其他冠状病毒比较相对较困难，虽能感染PK-15和ST等猪源细胞，但PEDV对其适性差，细胞病变不明显，培养困难[12-13]。目前，PEDV适应性最强的细胞为Vero细胞，且一定浓度的胰酶可以增强其对Vero细胞的感染性[14]。因此，本研究将处理过的病死仔猪的小肠及其内容物接种于Vero细胞，并加入含胰酶(终浓度为10 μg/mL)的细胞培养液，对PEDV进行分离鉴定，盲传第1代至第3代未见明显的CPE，盲传第4代以后，细胞有明显的皱缩、聚堆以及变圆等现象，盲传至第8代以后，细胞特征性病变明显，细胞呈现变圆、聚集、皱缩及最终脱落等病理现象。对分离株进行氯仿敏感性和核型鉴定，结果显示，该分离株对氯仿敏感性强但对BUDR不敏感，对分离株进行RT-PCR鉴定，结果成功扩增出PEDV M基因和N基因序列，因此最终确定该分离株为PEDV，将其命名为PEDV HZ株。

PEDV的M基因和N基因是其主要的结构蛋白基因，M基因在病毒装配以及出芽的过程中发挥重要作用，N基因在病毒核酸的转录复制中发挥一定的作用，并且N蛋白可诱发机体产生高效的免疫应答[13-14]。对分离株M基因和N基因与国内外其他PEDV分离株进行比较，M基因核苷酸的同源性为98.1%～100%，氨基酸的同源性为96.9%～99.6%，N基因核苷酸的同源性为93.9%～100%，氨基酸的同源性为93.0%～100%，分析结果表明，PEDV的M基因和N基因有较高的保守性。进化树分析表明，PEDV HZ株与中国株CHGD-01处于同一个进化分支，亲缘关系近。测定PEDV HZ株的TCID50为104.7/0.1 mL，说明该病毒的滴度高，有较高的体外培养稳定性。本试验通过病毒的分离培养、理化特性鉴定、RT-PCR鉴定及序列分析从陕西省某养猪场送检的病死仔猪的小肠病料中分离到一株PEDV，将其命名为PEDV HZ株，为后续PEDV的分子生物学研究奠定了基础。

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Isolation and Identification of Porcine Epidemic Diarrhea Virus HZ Strain

PANG Wen-jing,FU Ming-zhe,XU Xin-gang,GUO Kang-kang,ZHANG Qi

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China)

A virus strain was isolated from intestinal contents of dead piglets from a pig farm in Shaanxi province.The inoculated Vero cells showed the stable cytopathogenic effect after the eighth generation.The PEDV virus strain was finally confirmed by physicochemical tests,TCID50assay,RT-PCR identification and sequence alignment,and it was named as PEDV HZ strain.The total RNA of isolated strain was as template,the N and M genes of 681 bp and 1 326 bp were amplified by RT-PCR.The nucleotide sequences of M and N genes of PEDV HZ strain shared 98.1%-100% and 93.9%-100% identity with other domestic and foreign virus strains.The amino acids sequences of M and N genes of PEDV HZ strain shared 96.9%-99.6% and 93%-100% identity with other domestic and foreign virus strains.The phylogenetic trees showed that PEDV HZ strain had a closer relationship with the CHGD-01 strain.

Porcine epidemic diarrhea virus; isolation and identification; M gene; N gene; sequence analysis

2016-10-29

陕西省农业科技创新与攻关项目(2016NY-095)；西北农林科技大学基本科研业务费项目(Z109021427)

庞文静(1991-)，女，江苏连云港人，硕士研究生，主要从事分子病原学与免疫学研究。*通讯作者

S852.659.6

A

1007-5038(2017)07-0027-04