Aurora A激酶抑制剂MLN8237对乳腺癌细胞增殖及凋亡的影响

张月，孙光源，姜伟华，孙健，范敬静，信国峰，宋文丽，武雪亮，张志生(河北北方学院附属第一医院，河北张家口075000)



Aurora A激酶抑制剂MLN8237对乳腺癌细胞增殖及凋亡的影响

张月，孙光源，姜伟华，孙健，范敬静，信国峰，宋文丽，武雪亮，张志生
(河北北方学院附属第一医院，河北张家口075000)

目的 观察Aurora A激酶抑制剂MLN8237对体外培养的人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法 取乳腺癌MCF7细胞分为两组，观察组分别加入0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L MLN8237，对照组不加MLN8237。用MTT法检测各组细胞增殖抑制率，流式细胞术检测细胞周期，Western blotting法检测磷酸化Aurora A(p-Aurora A)激酶和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及细胞周期相关蛋白Cyclin B1的表达，Annexin Ⅴ-FITC与PI双染法检测细胞凋亡率。结果 观察组随MLN8237浓度和培养时间增加，细胞增殖抑制率增加，10 μmol/L MLN8237作用48 h的细胞增殖抑制率最高,0.01、0.1、1、10 μmol/L MLN8237作用24、48 h的细胞增殖抑制率均高于对照组(P均<0.05)。与对照组比较，观察组随MLN8237浓度增加，G0/G1期、S期细胞比例降低，G2/M期细胞比例升高。观察组各浓度与对照组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。与对照组比较，观察组随MLN8237浓度增加，p-Aurora A激酶、Bcl-2表达降低，Bax表达升高。与对照组比较，观察组随MLN8237浓度增加，细胞凋亡率增加，10 μmol/L MLN8237作用24 h的细胞凋亡率最高(P均<0.05)。结论 MLN8237能够抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖，并诱导细胞凋亡。

乳腺癌；MLN8237；Aurora激酶抑制剂；细胞增殖；细胞凋亡

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，严重影响妇女身心健康甚至危及生命。随着分子生物学的发展，肿瘤治疗进入了全新的分子靶向治疗时代。与全身、广泛性的放化疗相比，靶向治疗能够高效、有选择性地杀伤肿瘤细胞，减少对正常组织的损伤，不良反应较小。Aurora激酶家族是由Aurora A激酶、Aurora B激酶、Aurora C激酶组成的丝/苏氨酸蛋白激酶，其功能是进行各种有丝分裂活动和维持基因组的完整性，在细胞有丝分裂过程中起重要作用。目前已报道的Aurora激酶抑制剂大部分属于非选择性Aurora激酶抑制剂，存在较大的不良反应，寻找高效、低毒的选择性Aurora激酶抑制剂是靶向药物研究的趋势。MLN8237是一种新型特异性抑制Aurora A激酶的小分子抑制剂，对实体瘤细胞有诱导凋亡和抑制增殖的作用[1]，但其对乳腺癌MCF-7细胞的作用研究不多。2016年3～12月，我们通过观察MLN8237对体外培养人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其分子机制，为乳腺癌的靶向治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7细胞由河北北方学院中心实验室提供。MLN8237购自美国Selleck公司；RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自Hyclone公司；BCA蛋白分析试剂盒购自美国Pierce公司；p-Aurora A激酶、Aurora A激酶、Bcl-2、Bax、Cyclin B1一抗购于美国Cell Signaling Technology公司；FITC-Annexin Ⅴ凋亡试剂盒购于美国BD公司。

1.2 细胞培养与分组处理 将MCF-7细胞加入含10%胎牛血清、人青霉素和链霉素各100 μg/mL的RPMI1640培养液中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞分为观察组和对照组，观察组分别加入0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L的MLN8237，对照组不加MLN8237。

1.3 细胞增殖观察 采用MTT法。取对数生长期细胞，制成1×104/mL的细胞悬液，以0.1 mL/孔接种于96孔板。培养24、48 h后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，继续培养4 h后弃上清，加入二甲基亚砜，充分震荡溶解显色，使用酶标仪于波长570 nm处检测各孔吸光度值(A值)，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(对照组A值-观察组A值)/对照组A值×100%。

1.4 细胞周期观察 取对数生长期细胞，培养24 h后收集细胞，并调整细胞数至1×106/mL。加入预冷的95%乙醇固定，离心，弃乙醇，加入PI(50 μg/mL)与RNase(1 μg/mL)混合物500 μL作用15 min后，上流式细胞仪检测1×104个细胞，用Multicycle软件分析细胞周期。

1.5 细胞凋亡观察 取对数生长期细胞，培养24 h后收集细胞，并调整细胞数至1×106/mL。用冷PBS洗涤，加入Binding缓冲液100 μL、FITC Annexin-Ⅴ 5 μL、PI 50 μg/mL 10 μL，室温避光孵育15 min。加入Binding缓冲液400 μL到细胞悬液中，继续孵育20～30 min。上流式细胞仪FACScan测定凋亡细胞数，计算细胞凋亡率。

1.6 细胞p-Aurora A激酶、Bcl-2、Bax及Cyclin B1表达检测 采用Western blotting法检测细胞中p-Aurora A激酶和凋亡蛋白Bcl-2、Bax及细胞周期蛋白Cyclin B1表达。取细胞蛋白样品30 μg，行10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，37 mA恒流1 h将蛋白电转移至PVDF膜上，用含5%牛奶TBST封闭纤维素膜0.5 h，加入一抗(抗体稀释比例为1∶1 000)4 ℃过夜，TBST洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(抗体稀释比例为1:10 000)，室温孵育1 h后TBST洗涤3次，ECL显影，曝光。以目的条带与内参条带的光密度比值作为目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 两组细胞增殖抑制率比较 观察组MLN8237浓度较高组的细胞增殖抑制率较浓度较低组升高，作用48 h时的细胞增殖抑制率较24 h时升高。0.01、0.1、1、10 μmol/L MLN8237作用24、48 h的细胞增殖抑制率均高于对照组(P均<0.05)，10 μmol/L MLN8237作用48 h的细胞增殖抑制率最高。见表1。

表1 两组细胞增殖抑制率比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.2 两组细胞周期比较与对照组比较 观察组MLN8237浓度较高组的G0/G1期、S期细胞比例较浓度较低组下降，G2/M期细胞比例升高。观察组各浓度与对照组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2 两组细胞周期比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.3 两组细胞凋亡率比较 观察组加入MLN8237 0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L培养24 h后，细胞凋亡率分别为2.67%±0.22%、5.26%±0.34%、8.41%±0.11%、11.04%±0.21%、29.59%±1.76%，对照组为2.51%±0.17%。与对照组比较，观察组0.01、0.1、1、10 μmol/L MLN8237作用下细胞凋亡率均升高(P均<0.05)。观察组MLN8237浓度较高组的细胞凋亡率较浓度较低组增加，10 μmol/L MLN8237作用24 h的细胞凋亡率最高(P均<0.05)。

2.4 两组细胞p-Aurora A激酶、Bcl-2、Bax、Cyclin B1蛋白相对表达量比较 与对照组比较，观察组0.01、0.1、1、10 μmol/L MLN8237作用下细胞p-Aurora A激酶、Bcl-2、Cyclin B1蛋白表达降低，Bax蛋白表达升高(P<0.05)。观察组MLN8237浓度较高组的p-Aurora A激酶、Cyclin B1、Bcl-2蛋白表达较浓度较低组下降，Bax蛋白表达逐渐升高(P<0.05或<0.01)。见表3。

表3 两组细胞p-Aurora A激酶、Bcl-2、Bax、Cyclin B1蛋白相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

Aurora激酶是中心体相关激酶，存在于真核细胞内，在中心体复制、两极纺锤体形成、染色体重排和染色体检查点检测等重要的有丝分裂过程中发挥重要作用[2]。Aurora激酶的异常表达很可能干扰有丝分裂中检查点的功能，导致遗传不稳定和诱发肿瘤增长[3]。Aurora激酶与恶性肿瘤的关系，使其作为靶点治疗癌症成为可能。选择性Aurora激酶抑制剂的研究主要是针对Aurora B激酶，针对Aurora A激酶的选择性抑制剂很少[4]。但相对于Aurora B激酶而言，Aurora A激酶在卵巢癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤中均呈过表达，对乳腺癌的治疗具有指导意义[5]。Aurora A激酶的功能与中心体的分离和成熟以及纺锤体装配有关，通过激活纺锤体的检查点，从而导致有丝分裂终止，形成异倍体[6]。Aurora A激酶高表达打乱了中心体和微管的动态平衡，基因组稳定性发生改变，从而导致肿瘤发生[7]。Aurora A激酶的mRNA、蛋白表达在G1期和S期均处于相当低的水平，在G2期和M期升高至峰值，当一个细胞周期结束进入下一个周期的G1期时，Aurora A激酶的表达迅速下降[8]。

作为第2代Aurora A激酶特异性抑制剂MLN8237，对实体瘤和血液系统恶性肿瘤表现出了良好的疗效[9]。Aurora A激酶通过与其底物结合，发生自身磷酸化从而被激活，激活Aurora A激酶的底物和Aurora A激酶抑制剂之间的平衡对正常的有丝分裂是非常重要的[10]。本研究观察了MLN8237对乳腺癌MCF-7细胞的增殖和凋亡的影响，结果显示，与对照组比较，10 μmol/L MLN8237作用于MCF-7细胞24、48 h的细胞增殖抑制率分别达到64.88%±0.01%、82.21%±0.01%，与对照组比较，随着MLN8237浓度增加，细胞凋亡率升高，凋亡细胞明显增加。

MLN8237是潜在的选择性Aurora激酶抑制剂，在肿瘤细胞中对Aurora A激酶的选择性大于Aurora B激酶，可抑制磷酸化Aurora A激酶的表达。Cyclin B1是细胞周期中的一种重要的蛋白，使细胞通过G2/M期的检查点，促进细胞G2/M期转换，它在有丝分裂中后期被降解，促进有丝分裂完成，促使细胞周期的运行[11，12]。通过MLN8237药物干扰使细胞Cyclin B1表达降低，G2/M期进展延迟[13]，抑制有丝分裂细胞的聚集，凋亡相关蛋白Bcl-2与Bax的表达呈相反趋势，即Bax蛋白表达增加，Bcl-2蛋白表达减少，细胞进入凋亡。本研究显示，加入MLN8237后，细胞周期出现明显的G2/M期阻滞，G0/G1期、S期细胞比例降低，G2/M期细胞比例升高。同时，流式细胞术Annexin-Ⅴ/PI双染显示随着MLN8237浓度的增加，细胞凋亡率升高，凋亡细胞增加。

Aurora A激酶转化为p-Aurora A激酶发挥活性。MLN8237干扰后，p-Aurora A激酶表达减少，Cyclin B1被激活，从而延迟G2/M期的进展，抑制有丝分裂细胞的聚集，使细胞发生增殖抑制。本研究显示，MCF-7细胞p-Aurora A激酶表达随MLN8237浓度增加而降低。随药物浓度增加，Cyclin B1表达降低，细胞出现增殖抑制及细胞周期阻滞，说明细胞的增殖抑制最终可能与下调Cyclin B1表达、不能有效调节G2/M期细胞周期进展有关。

综上所述，MLN8237能够抑制乳腺癌细胞中Aurora A激酶磷酸化，下调Cyclin B1表达，使细胞发生G2/M期阻滞，形成异倍体细胞，抑制细胞周期进程；Bcl-2表达下降，Bax表达增加，抑制乳腺癌细胞增殖并诱导细胞凋亡，可为乳腺癌的靶向治疗提供理论基础。

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医药学名词常见错误及正确写法

药品名称：错误(正确)

二磷酸腺苷(腺苷二磷酸)，消炎痛(吲哚美辛)，阿斯匹林(阿司匹林)，维甲酸(维A酸)，双磷酸盐(双膦酸盐)，甲氨喋呤(甲氨蝶呤)，博莱霉素(博来霉素)，开浦兰(左乙拉西坦)，雷公多苷(雷公藤多苷)，非那根(异丙嗪)，四乙铵(四乙胺)，洗必泰(氯已定)，美息律(美西律)，大环内脂类(大环内酯类)，川穹(川芎)，酒精(乙醇)，头胞哌酮(头孢哌酮)。

疾病及其相关名称：错误(正确)

甲状腺机能(甲状腺功能)，血沉(红细胞沉降率)，X光片(X线片)，帕金森症(帕金森病)，食道(食管)，适应征、适应症(适应证)，禁忌征、禁忌症(禁忌证)，酒精肝(酒精性肝病)，心肌梗塞(心肌梗死)，脑梗塞(脑梗死)，毒副反应(不良反应)，肌肉注射(肌内注射)，心率失常(心律失常)，中风(卒中)，生理机能(生理功能)，返流(反流)，血液动力学(血流动力学)，机能(功能)，人流(人工流产)，药动学(药代动力学)，绿脓杆菌(铜绿假单胞菌)，机理(机制)，围产期(围生期)，氧和指数(氧合指数)，慢性阻塞性肺病(慢性阻塞性肺疾病)，血管紧张素转换酶(血管紧张素转化酶)，血管紧张肽转换酶抑制剂(血管紧张素转化酶抑制剂)，咳血(咯血)，心房纤颤(心房颤动)，脑溢血(脑出血)，稳定性心绞痛(稳定型心绞痛)，法乐四联症(法洛四联症)，非何杰金淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)，视网膜神经胶质瘤(视网膜母细胞瘤)，剖腹产术(剖宫产术)。

其他：错误(正确)

粘附(黏附)，粘痰(黏痰)，粘液(黏液)，粘滞(黏滞)，粘膜(黏膜)，粘多糖(黏多糖)，多粘菌素(多黏菌素)，粘质沙雷菌(黏质沙雷菌)，层黏联蛋白(层黏连蛋白)，机率、几率(概率)，脱腊(脱蜡)，侧枝循环(侧支循环)，纵膈(纵隔)，红血球(红细胞)，白血球(白细胞)。

Effects of Aurora kinase inhibitor on proliferation and apoptosis of breast cancer cells

ZHANGYue,SUNGuangyuan,JIANGWeihua,SUNJian,FANJingjing,XINGuofeng,SONGWenli,WUXueliang,ZHANGZhisheng

(FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity,Zhangjiakou075000,China)

Objective To investigate the effects of Aurora kinase inhibitor MLN8237 on proliferation and apoptosis of human breast cancer cells cultured in vitro. Methods MCF7 cells were divided into two groups, including the control group (without MLN8237) and the observation group (added with 0.001, 0.01, 0.1, 1, and 10 μmol/LMLN8237). The cell proliferation inhibitory rate was examined by MTT assay. Cell cycle of MCF7 cells was determined by flow cytometry. The expression levels of phosphorate-Aurora A (p-Aurora A), apoptosis-related proteins Bcl-2, Bax, and cell cycle-related Cyclin B1 protein were detected by Western blotting. The apoptotic rate was tested by Annexin V-FITC and PI staining. Results MLN8237 (0.01, 0.1, 1, 10 μmol/L ) significantly inhibited the proliferation of MCF7 cells after 24-hour or 48-hour treatment in a dose-dependent and time-dependent manner in the observation group as compared with that of the control group, and the highest inhibition was found at 10 μmol/L MLN8237 after 48-hour treatment (allP<0.05). With the increasing concentrations of MLN8237, the percentage of cells in G2/M phase increased, the percentage of cells in G0/G1and S decreased in the observation group as compared with that of the control group, and there was statistically significant difference between these two groups (allP<0.05). Compared with the control group, with the increasing concentrations of MLN8237, the expression of p-Aurora A kinase and Bcl-2 decreased, the expression of Bax increased, the apoptosis rate increased and the highest apoptotic inhibition rate was found at 10 μmol/L MLN8237 after 24-hour treatment in the observation group (allP<0.05). Conclusion MLN8237 inhibits the proliferation and induces the apoptosis of MCF7 cells.

breast carcinoma; MLN8237; Aurora kinase inhibitor; cell proliferation; apoptosis

河北省医学科学研究重点课题(ZD20140243)。

张月(1984-)，女，硕士，主治医师，主要研究方向为乳腺疾病的诊治与基础研究。E-mail: zhangyue906@163.com

张志生(1970-)，男，主任医师，硕士生导师，主要研究方向为乳腺疾病的基础与临床诊治。E-mail: yfyzzs@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.004

R737.9

A

1002-266X(2017)26-0013-04

2017-03-18)