沉默MACC1基因对人卵巢癌耐药细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

邓佑兴，史惠蓉，李霞，张瑞涛(郑州市妇幼保健院，郑州45005；郑州大学第一附属医院)



沉默MACC1基因对人卵巢癌耐药细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

邓佑兴1，史惠蓉2，李霞2，张瑞涛2
(1郑州市妇幼保健院，郑州450052；2郑州大学第一附属医院)

目的 观察应用基因沉默技术抑制人卵巢癌耐药细胞结肠癌转移相关基因1(MACC1)表达后，细胞增殖、凋亡和侵袭能力的变化及其分子机制。方法 将人卵巢癌耐药细胞株SKOV-3/DDP分成空质粒组和转染组，分别转染空质粒p-super-EGFP、重组质粒p-super-EGFP-MACC1 shRNA，另取未经处理的SKOV-3/DDP细胞作为空白对照组。采用RT-PCR方法检测各组MACC1 mRNA表达，Western blotting法检测MACC1蛋白表达，MTT法检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡情况，体外黏附试验检测细胞体外黏附力，Transwell小室检测细胞侵袭能力，Western blotting法测定C-met、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达。结果 与空白对照组和空质粒组比较，转染组MACC1 mRNA和蛋白表达减少，细胞48、72 h增殖能力减弱，细胞凋亡率增加，体外黏附和侵袭能力减弱，C-met、p-ERK1/2蛋白表达增加(P均<0.05)，而空白对照组和空质粒组各指标差异无统计学意义(P均>0.05)。结论 MACC1基因表达抑制后，SKOV-3/DDP的增殖、黏附和侵袭能力减弱，细胞凋亡增加，这可能与HGF/C-met和ERK通路受抑制有关。

卵巢癌；结肠癌转移相关基因1；细胞增殖；细胞凋亡；细胞侵袭

卵巢癌的病死率居妇科恶性肿瘤首位。由于卵巢居于盆腔深部，卵巢癌常缺乏早期特异性症状，绝大部分卵巢癌患者就诊时已是晚期[1]。卵巢癌复发、转移是影响晚期卵巢癌患者预后的重要因素。结肠癌转移相关基因1(MACC1)是一种与结肠癌密切相关的基因，与结肠癌的增殖和转移密切相关[2]。研究表明，胃癌[3]、乳腺癌[4]、肝癌[5]等多种肿瘤中MACC1基因存在异常高表达，MACC1可促进肿瘤生长、侵袭。但是MACC1对卵巢癌耐药细胞增殖、凋亡和侵袭的影响及其分子机制，目前少见报道。肝细胞生长因子(HGF)/C-met信号传导通路是与恶性肿瘤生长、转移相关的信号通路，ERK通路是与恶性肿瘤细胞增殖、恶性转化和侵袭有关的通路。2014～2016年，我们采用RNA干扰技术沉默卵巢癌耐药细胞系SKOV-3/DDP中MACC1基因表达，观察卵巢癌耐药细胞体外增殖、凋亡和侵袭能力的变化，并检测HGF/C-met通路蛋白C-met和ERK通路蛋白ERK1/2、p-ERK1/2表达，探讨其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人卵巢癌耐药细胞株SKOV-3/DDP购自中国医学科学院肿瘤细胞库。真核荧光表达质粒p-super-EGFP-1和重组质粒p-super-EGFP-MACC1 shRNA由郑州大学第一附属医院妇产科实验室构建；RevertAid First Strand cDNA购自加拿大Formentas公司；DNA&siRNA InterferinTM转染试剂购于美国Polyplus Transfection公司；Matrigel基质膜购于美国BD公司；MTT购自美国Sigma公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自南京凯基公司；兔抗人MACC1抗体购自英国Abcam公司；兔抗人C-met、兔抗人ERK1/2、p-ERK1/2抗体购自北京博奥森公司；兔抗人MMP-2抗体、兔抗人MMP-9抗体、兔抗人β-actin抗体、兔抗人caspase-3抗体、兔抗人cleaved caspase-3抗体及羊抗兔单克隆IgG购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 细胞培养与分组处理 将SKOV-3/DDP细胞分别加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中常规培养、传代。待细胞培养至70%～80%融合时，提取细胞用于实验。使用质粒小量提取试剂盒提取重组质粒，应用DNA&siRNA InterferinTM转染试剂进行细胞转染。将细胞分成空质粒组和转染组，分别转染空质粒p-super-EGFP、重组质粒p-super-EGFP-MACC1 shRNA。另取未经处理的SKOV-3/DDP细胞作为空白对照组。

1.3 细胞MACC1 mRNA表达检测 采用RT-PCR方法。取对数生长期细胞，TRIzol试剂盒提取细胞总RNA，反转录合成cDNA。以β-actin为内参基因，设计并合成引物。MACC1基因上游引物5′-CCTTCGTGGTAATAATGCTTCC-3′，下游引物5′-AGGGCTTCCATTGTATTGAGGT-3′，产物696 bp；β-actin上游引物5′-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3′，下游引物5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′，产物220 bp。PCR反应条件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s、53 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s循环35次，最后72 ℃ 5 min，4 ℃终止。1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察、拍照，Image J软件分析PCR图像。以MACC1与β-actin灰度值的比值代表MACC1 mRNA的相对表达量。实验重复3次。

1.4 细胞MACC1蛋白表达检测 采用Western blotting法。取对数生长期细胞，RIPA法提取总蛋白。10%SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜加入一抗(兔抗人MACC1 1∶500，兔抗人β-actin 1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，加入二抗(羊抗兔1∶1 000)室温孵育1 h，ECL化学发光法显色。以β-actin作为内参，采用Image J软件分析特异性蛋白条带灰度值。

1.5 细胞增殖能力观察 采用MTT法。将三组细胞分别以5×103/孔接种至96孔板，在37 ℃、5% CO2条件下培养。于培养24、48、72 h后加入5 mg/mL MTT 10 μL，继续培养4 h。弃上清，加入100 μL DMSO，酶标仪测定A490分光光度值，绘制细胞增殖曲线。

1.6 细胞凋亡观察 采用FCM法。分别将3组细胞接种至6孔板。培养至70%～80%融合后，收集细胞，PBS冲洗，4 ℃离心，500 μL binding buffer悬浮细胞，再加入5 μL Annexin V-FITC混匀，加入400 μL PI，混匀后室温避光反应15 min。用流式细胞仪测定细胞凋亡情况。

1.7 细胞体外黏附能力观察 采用细胞黏附实验。将Matrigel利用无血清的RPMI1640配成0.04 μg/μL的人工基底膜胶。96孔板中每孔覆以50 μL Matrigel并风干，每孔加入1×105/mL的SKOV-3/DDP细胞，37 ℃、5% CO2湿度的培养箱中培养2 h。每孔加入MTT 10 μL后继续培养4 h后，分别在每孔加入200 μL DMSO，振荡10 min后在酶标仪490 nm处读取吸光度A值，以A值大小表示黏附细胞的数量多少。每组设3个复孔，实验重复3次。

1.8 细胞侵袭能力观察 收集3组细胞制成细胞悬液，调整细胞密度为2×105/mL。Transwell上室先预铺稀释的Matrigel，取200 μL细胞加入Transwell上室，下室中加入500 μL含5% FBS的RPMI1640培养液，培养24 h后取出小室，固定，染色，湿棉签轻轻擦去膜上细胞，封固。每张膜中间部分和周围部分各随机取5个视野，光学显微镜下计数每个视野内的细胞数，取平均值。以侵袭细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力。

1.9 HGF/C-met通路蛋白C-met和ERK通路蛋白ERK1/2、p-ERK1/2表达检测 方法同1.4。一抗兔抗人C-met(1∶100)，兔抗人ERK1/2(1∶100)，兔抗人p-ERK1/2(1∶100)，兔抗人β-actin(1∶1 000)，二抗(羊抗兔1∶1 000)。

2 结果

2.1 三组MACC1 mRNA和蛋白表达比较 转染组MACC1 mRNA和蛋白表达均低于其他两组(P均<0.05)，转染组和空质粒组MACC1 mRNA和蛋白表达比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 三组MACC1 mRNA和蛋白表达比较

2.2 三组细胞增殖能力比较 转染组、空质粒组、空白对照组24 h时的细胞增殖A值分别为0.192±0.001、0.211±0.002、0.210±0.002，组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。48、72 h时转染组A值低于其他两组(P均<0.05)，空白对照组与空质粒组间比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

2.3 三组细胞凋亡率比较 转染组、空质粒组和空白对照组的细胞凋亡率分别为15.74%±0.60%、4.52%±0.64%、3.72%±0.54%。转染组细胞凋亡率高于其他两组(P均<0.05)，空白对照组和空质粒组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 三组细胞体外黏附能力比较 转染组、空质粒组、空白对照组的A值分别为0.335±0.002、0.449±0.001、0.451±0.003，转染组低于其他两组(P均<0.05)，空白对照组与空质粒组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5 三组细胞侵袭能力比较 转染组、空质粒组和空白对照组的穿膜细胞数分别为(22.57±3.71)、(61.56±3.80)、(61.25±3.72)个。转染组穿膜细胞数少于其他两组(P均<0.05)，空质粒组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.6 三组C-met、ERK1/2、p-ERK1/2表达比较 转染组C-met、p-ERK1/2表达较其他两组减少(P均<0.05)，三组ERK1/2表达比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 三组C-met、ERK1/2、p-ERK1/2表达比较

注：与转染组比较，*P<0.05。

3 讨论

MACC1最早是在结肠癌中发现的一个新的基因，参与结肠癌的发生、发展过程，可以作为预示结肠癌转移和预后的因子[6]。随后研究者在膀胱癌[7]、胆囊癌[8]、胶质瘤[9]中也发现了MACC1的存在，其与肿瘤血管的生成、生长、凋亡、侵袭转移等生物学行为密切相关。Zhou等[10]发现，宫颈癌组织中MACC1表达高于正常宫颈组织，MACC1高水平与盆腔淋巴结转移、复发和低生存率显著相关。Xu等[7]应用RNAi技术抑制膀胱癌中MACC1表达后，膀胱癌细胞增殖和侵袭能力减弱。华方方等[11]研究发现，宫颈癌SiHa细胞中MACC1表达下调可显著抑制细胞增殖，改变细胞周期分布，减弱细胞侵袭能力。Wang等[8]发现，下调MACC1显著抑制胆囊癌细胞生长和细胞侵袭。本研究显示，与空白对照组和空质粒组比较，转染组MACC1 mRNA和蛋白表达较减少，细胞48、72 h增殖能力减弱，凋亡率增加，体外黏附和侵袭能力减弱。表明采用基因沉默技术抑制SKOV-3/DDP中MACC1基因表达，能够降低MACC1基因和蛋白表达，减弱卵巢癌细胞增殖能力，增加癌细胞凋亡，减弱癌细胞体外黏附和侵袭能力。提示MACC1在卵巢癌耐药细胞的增殖、凋亡和侵袭中发挥重要作用。

MACC1对肿瘤细胞的增殖、凋亡以及侵袭转移的作用是通过复杂的信号通路完成的。研究表明，HGF/C-met信号传导通路是一个明确的与恶性肿瘤生长、转移相关的信号通路，MACC1基因可通过与MET基因启动子结合，调控MET基因的活性和C-met蛋白的表达，激活HGF/C-met通路；C-met蛋白酪氨酸残基磷酸化后，导致细胞内多条信号通路包括ERK通路的级联激活，最终促进细胞增殖、血管生成以及上皮-间质转化、细胞侵袭，引起肿瘤生长和转移[2]。另外，MACC1蛋白可通过自身SH3结构域以及酪氨酸、丝/苏氨酸激酶磷酸化位点作用于生长因子受体蛋白相关的信号通路，激活Ras-Rho-RacG蛋白家族成员，参与ERK通路的调节[12，13]。因此，猜测MACC1可能通过HGF/C-met信号通路和ERK信号通路参与对肿瘤细胞生物学行为的调节。

Stein等[2]在结肠癌细胞中转染外源性MACC1，发现HGF介导的结肠癌细胞播散作用可被ERK通路抑制剂PD98059或UO126抑制，提示外源性MACC1高表达可激活ERK通路。Wang等[14]发现沉默MACC1基因后，胰腺癌细胞增殖和侵袭能力减弱，ERK通路被抑制。本研究结果显示，与空白对照组和空质粒组比较，转染组C-met、p-ERK表达减少。表明采用基因沉默技术抑制SKOV-3/DDP中MACC1基因表达，能够降低HGF/C-met信号通路关键因子C-met、ERK信号通路关键因子p-ERK蛋白表达。提示MACC1对SKOV-3/DDP细胞增殖、凋亡及侵袭的调节可能是通过HGF/C-met信号通路和ERK信号通路来完成的。

综上所述，MACC1可能通过调节HGF/C-met信号通路和ERK1/2信号通路以及多种通路的最终共同效应分子，对卵巢癌细胞的增殖、凋亡以及体外侵袭进行调控。

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Effects of MACC1 silencing on proliferation, apoptosis, and invasion of human ovarian cancer drug-resistant cell line

DENGYouxing1,SHIHuirong,LIXia,ZHANGRuitao

(1MaternalandChildHealthCareHospitalofZhengzhou,Zhengzhou450052,China)

Objective To observe the proliferation, apoptosis, and invasion changes of human ovarian cancer drug-resistant cell line after metastasis-associated in colon cancer-1 (MACC1) silencing by using gene silencing technique and its possible mechanism. Methods The human ovarian cancer drug-resistant SKOV-3/DDP cells were divided into the empty plasmid group and the transfection group, which were transfected with p-super-EGFP and p-super-EGFP-MACC1 shRNA. In addition, the untreated SKOV-3/DDP cells were taken as the control group. The expression of MACC1 mRNA was detected by RT-PCR,Western blotting was used to detect the expression of MACC1 protein, MTT assay was used to detect cell proliferation, flow cytometry was used to detect the apoptosis, the adhesion test was used to detect the adhesion of cells in vitro, Transwell chamber was used to detect cell invasion, and the protein expression of C-met, ERK1/2 and p-ERK1/2 was detected by Western blotting.Results Compared with the blank control group and empty plasmid group, the MACC1 mRNA and protein levels were lower, the proliferation ability decreased at 48 and 72 h, apoptosis rate increased, the adhesion and invasion abilities increased, the expression of C-met, p-ERK1/2, MMP-2, MMP-9, and Caspase-3 decreased, and the expression of cleaved caspase-3 protein increased in the transfection group (allP<0.05). There was no statistically significant difference between the blank control group and empty plasmid group (allP>0.05).Conclusion Silencing MACC1 gene inhibits the proliferation, adhesion, and invasion abilities of SKOV-3/DDP cells, and promotes apoptosis, which may be related to the inhibition of HGF/C-met and ERK1/2 pathway.

ovarian carcinoma; metastasis-associated in colon cancer-1; cell proliferation; apoptosis; cell invasion

邓佑兴(1987-)，女，住院医师，主要研究方向为妇科肿瘤。E-mail： dengyouxing1987@163.com

史惠蓉(1956-)，女，主任医师，主要研究方向为妇科肿瘤。E-mail： huirongshi2011@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.006

R737.31

A

1002-266X(2017)26-0021-04

2017-02-18)