肾移植术后患者西罗莫司血药浓度的测定

邹 静，肖洪涛，李晋奇，师健友，王 婷

(四川省医学科学院·四川省人民医院药学部，四川 成都 610072)

肾移植术后患者西罗莫司血药浓度的测定

邹 静，肖洪涛，李晋奇，师健友，王 婷

(四川省医学科学院·四川省人民医院药学部，四川 成都 610072)

目的 建立肾移植术后患者西罗莫司血药浓度的液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)测定方法。方法选取服用FK506/CsA+西罗莫司+糖皮质激素三联免疫治疗的肾移植术后患者20例，采集西罗莫司谷浓度全血样本，以达那唑为内标，经沉淀蛋白及液液萃取处理后，经液相色谱分离，采用ESI离子源，以SIR正离子方式进行检测，检测离子为m/z 936.76(西罗莫司)，m/z 338.26(内标)。同时将所建立的HPLC-MS法和微粒子酶免疫法(MEIA)分别测定肾移植患者全血西罗莫司浓度，评价两种分析方法测定结果的一致性。结果西罗莫司在0.2～100 μg/L范围内线性关系良好(r=0.9992)，最低定量限为0.2 μg/L。日内、日间精密度均小于6%，方法学回收率为92.93%～102.98%。两种方法测得的数据相关系数为0.979(P＜0.05)，两组数据间存在相关性(n=20)。当西罗莫司浓度在1.9～11.1 μg/L时，两种方法测定的平均偏差为1.4 μg/L。结论本文建立的HPLC-MS测定方法快速、准确、灵敏、选择性高，适用于临床对西罗莫司的血药浓度监测;HPLC-MS法和MEIA法测定西罗莫司全血浓度存在相关性，同一份样本用MEIA测定的浓度均值比HPLC-MS法测定的值高。

西罗莫司;达那唑;高效液相色谱法-质谱联用;血药浓度监测;微粒子酶免疫法

西罗莫司(雷帕霉素)是由链霉菌属产生的大环内酯类抗生素，是一种疗效好、低毒、尚未发现有明显肾毒性的免疫抑制剂［1］，因西罗莫司引起的可逆性副作用，如高脂血症、白细胞及血小板减少症、肺炎增加倾向等，在血药浓度由30 μg/L降至15 μg/L后均有好转［2］，因此当器官移植后出现肝肾功能不全或他克莫司(FK506)、环孢霉素(CsA)不能达到理想的药物浓度时，西罗莫司是作为替换治疗或辅助治疗的最佳选择之一。

西罗莫司有效血药浓度范围窄，其口服生物利用度仅为14%～15%［3］，且由于患者疾病状态、器官移植类型、年龄、剂量等因素在药物吸收和代谢上都可能存在个体差异，因此不易估计给药后的血药浓度。此外，治疗过程中的合并用药、影响细胞色素P4503 A酶系的药物都能引起血药浓度的改变。对大部分患者而言，药物的疗效、毒副作用与血药浓度成正相关，因此测定个体血药浓度以调整用药的剂量和次数、制定个体化治疗方案在临床上有着至关重要的意义。HPLC法测定西罗莫司浓度的方法已有文献报道［4～6］。但这些方法中有的采用较为昂贵的LC-MS/MS，有些尚需难以获得的特殊内标。本文建立用LC-MS法测定SRL的全血药物浓度，以满足医院对其进行血药浓度监测的日常需求。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 肾移植术后患者血药采集 2011年5月～7月选取服用FK506/CsA+西罗莫司+糖皮质激素三联免疫治疗的肾移植术后患者20例，年龄20～65周岁，处于肾移植稳定状态。患者口服西罗莫司剂量为1～2 mg/天，1次/天，西罗莫司血药浓度首次测定可在术后第7～10天后的谷值血药浓度，第1个月内每周测定1～2次，第2个月每周测定1次，之后每个月测定1次，采血时间为即将服西罗莫司前抽血。

1.1.2 试剂与仪器 西罗莫司测定试剂盒与西罗莫司质控及校准品系列，均为美国Abbott公司提供。Waters 2695高效液相色谱仪(美国 Waters公司)，含系统控制器，四元低压梯度输液泵，全自动进样器，柱恒温箱，MassLynx4.0色谱数据工作站;色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18(100×2.1 mm，3.5 μm);BP211D电子分析天平(德国沙多利斯公司);IMx分析仪(美国Abbott公司)。甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)，乙腈(色谱纯，美国Fisher公司);水为超纯水;对照品:西罗莫司对照品(批号:0709022P，纯度:99.5%，浙江省药品检验所);内标达那唑(I．S．)对照品(批号:100126-200402，供含量测定用，中国药品生物制品检定所)。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 流动相:H2O-乙腈-甲醇 (27:45:28，v/v);流速:0.2 ml/min，柱温:60 ℃。

1.2.2 质谱条件 电喷雾电离源(ESI+)，采用选择离子监测模式同时测定西罗莫司(［M+Na］+，m/z 936.76)，内标达那唑(［M+H］+，m/z 338.26);毛细管电压3.4 kV;椎孔电压(西罗莫司72 V，达那唑28 V);二级椎孔电压2 V;六级杆透镜电压0.2 V;源温度120℃;脱溶剂气温度350℃;脱溶剂气流量700 L/h;锥孔气流量50 L/h。

1.2.3 溶液、标准曲线和质控样品的配制 ① 对照品溶液:精密称取西罗莫司对照品5.03 mg(相当于西罗莫司 5.005 mg)，以甲醇溶解，并定容于25 ml容量瓶中，混匀即成西罗莫司储备液(200.19 mg/L)。取西罗莫司储备液2.5 ml，以50%甲醇定容于50 ml容量瓶中，即得西罗莫司工作液(10.01 mg/L)，置-30℃冰箱储存备用。②内标溶液:精密称取达那唑标准品5 mg，以50%甲醇水溶液溶解，并定容于25 ml容量瓶中，即得内标储备液(200 mg/L)。取内标储备液1 ml，以50%甲醇水溶液定容于50 ml容量瓶中，即得内标工作液(4 mg/L)，置4℃冰箱储存备用。③标准曲线的制备:取西罗莫司工作液(10.01 mg/L)0.1 ml，置于10 ml容量瓶中，以空白人全血定容，混匀即得西罗莫司全血浓度100.1 μg/L，再以空白人全血按对倍稀释，配成各含50.05、20.02、10.01、5.005、2.002、1.001、0.5005、0.2002 μg/L西罗莫司的全血样品，置-30℃冰箱储存备用。④质控样品的配制。精密称取西罗莫司对照品4.97 mg(相当于西罗莫司4.945 mg)，以甲醇溶解，并定容于25 ml容量瓶中，混匀即成西罗莫司储备液(197.81 mg/L)。取西罗莫司储备液2.5 ml，以50%甲醇定容于50 ml容量瓶中，即得西罗莫司溶液(9.89 mg/L)，取9.89 mg/L的西罗莫司溶液0.08 ml，置于10 ml容量瓶中，以空白人全血定容，混匀即得西罗莫司全血高质控样品，浓度79.12 μg/L，再按此法配制得西罗莫司中质控样品(19.78 μg/L)，低质控样品(0.495 μg/L)，置-30 ℃ 冰箱储存备用。

1.2.4 样品预处理 取全血样品0.1 ml，加入25 μl内标工作液，漩涡混匀，加入5%ZnSO4、丙酮各150 μl，漩涡混匀 6 分钟后，12000 rpm，6 ℃离心 6 min，转移上清液于另一洁净圆底玻璃试管，加入4 ml叔丁基甲醚，漩涡萃取8 min，3000 rpm，6℃离心8 min，转移上层有机相于另一尖底试管;于(45±5)℃水浴通氮气流吹干。残渣加入80%甲醇120 μl旋涡混合1 min，加入环己烷2 ml旋涡萃取4 min，2200 rpm，6℃离心4 min，吸弃上层有机相，取下层水相10 μl进样。记录西罗莫司和内标离子流色谱图的色谱峰面积，计算西罗莫司和内标的峰面积比，从标准曲线求算样品中西罗莫司浓度。

1.2.5 方法学考察 ①标准曲线和线性范围:取标准曲线全血样品0.1 ml，加入25 μl内标工作液，按照“1.2.4样品预处理”进行操作，记录西罗莫司和内标离子流色谱图的色谱峰面积，以西罗莫司和内标峰面积比对应其浓度进行线性回归，考察线性。②精密度与回收率试验:取高、中、低质控样品各0.1 ml，于同批内连续测定5次，将记录峰面积比代入当日线性回归方程，计算西罗莫司浓度，以测得值与理论加入值之比计算方法学回收率，得到批内精密度与回收率;在不同天连续分3批每浓度各测定5次，计算批间精密度与回收率。③萃取回收率试验:按标准曲线方法配制并测定 100.1、10.01、0.495 μg/L三个浓度血样，每个浓度平行测定3份，所得峰面积与对照品溶液直接进样所得峰面积进行比较，计算萃取回收率。④基质效应:将高、中、低(79.12、19.78、0.495 μg/L)质控样品，按“1.2.4样品处理”操作，进样得峰面积A1，用相同体积的纯水代替空白全血，按“1.2.4样品处理”操作，记录色谱图峰面积A2，将A1与A2相除，即得绝对基质效应。⑤稳定性考察:根据样品测定过程中可能遇到的不稳定因素，实验先后考察了工作液-20℃保存的稳定性;全血样品在4℃放置7天的稳定性，和在－30℃保存0、8、14及30天的稳定性;全血样品反复冻融0、1、2次的稳定性;测定样品处理完后立即进样与室温放置4 h后进样的结果差异。

1.2.6 LC-MS法与MEIA法测定比较 目前，测定西罗莫司血药浓度的方法主要为免疫法和LC-MS法，因此将所建立的LC-MS法与微粒子酶免疫分析法(MEIA法)对同一样品的测定结果进行比较，考察两种测量方法的一致性。对于之前选择的20例肾移植术后患者，在采集谷浓度血样时，取其静脉血样2～3 ml，立即移入经EDTA处理的试管中，充分混匀，平均分为两份，分别采用LC-MS法和MEIA法进行测定。

MEIA法测定的主要步骤为:精确吸取样本全血150 μl加入离心管中，精确加入150 μl沉淀剂，振摇10秒，离心5分钟，转速10000转/分，取上清液150 μl置雅培IMx分析仪内，IMX分析仪将自动检测并打印结果。

1.3 统计学方法采用SPSS 19.0统计软件，以MEIA法所测的值为X变量，LC-MS法所测的值为Y变量，进行双变量相关分析，考察测定结果相关性。采用 MedCalc 17.4.4统计软件，进行 Bland-Altman分析，考察两个测量方法的一致性。

2 结果

2.1 方法专属性在选定测定条件下，根据质谱分析结果，进行SIR监测，西罗莫司和内标的m/z分别为936.76和338.26。空白血浆、西罗莫司和内标加空白血浆及血浆样品色谱图见图1～3。空白血浆中内源性杂质和代谢物不干扰西罗莫司及内标物的测定，保留时间分别为3.07 min和7.52 min。

2.2 方法学考察结果西罗莫司全血标准曲线回归方程:Y=7.63×10-3X+1.55×10-4(r=0.9992，weighting=1/X2)。表明西罗莫司在0.2002～100.1 μg/L范围内线性良好，最低定量限为0.2002 μg/L，其RSD为6.58%。萃取回收率试验结果显示，SRL萃取回收率为53.6%～58.9%。经试验测定计算高、中、低质控样品中基质效应分别为(97.01±6.52)%、(103.01±5.64)%及(93.0±8.25)%，RSD分别为9.3%、7.7%、11.1%。高、中、低质控样品精密度与回收率试验结果见表1。

稳定性考察结果显示，工作液－20℃冷冻保存29 d均能保持稳定，满足测定要求。西罗莫司全血样品在－30℃保存30 d，西罗莫司浓度结果稳定。对比测定冻融0、1、2次的全血样品以及4℃放置7 d的全血样品，测定结果表明，在冻融和4℃放置条件下西罗莫司浓度结果稳定。对比测定样品处理完后立即进样与室温放置4 h后进样，测定结果表明，预处理后残留物复溶后放置4 h西罗莫司测定结果稳定。

图1 LC-MS色谱图-空白全血 a:总离子色谱图;b:m/z 338.26色谱图;c:m/z 936.76色谱图;1:内标，2:西罗莫司

图2 LC-MS色谱图-空白全血加标液 a:总离子色谱图;b:m/z 338.26色谱图;c:m/z 936.76色谱图;1:内标，2:西罗莫司

图3 LC-MS色谱图-肾移植术后患者口服西罗莫司后全血样品 a:总离子色谱图;b:m/z 338.26色谱图;c:m/z 936.76色谱图;1:内标，2:西罗莫司

表1 SRL在人全血中的方法学回收率与批内、批间精密度 (n=5)

2.3 统计分析结果双变量相关分析得出，r=0.979(P＜0.05)，提示两组数据间存在相关性，回归方程为Y=0.729X+0.1021。收集的20份样本浓度在 1.9～11.1 μg/L，相对于 LC-MS，MEIA 的平均百分偏差为32.3%，平均偏差为1.43 μg/L。对两组数据进行Bland-Altman偏差分析，见图4。结果显示，同一份样本用 MEIA测定的浓度均值比HPLC-MS法测定的值高。

图4 两种方法测定数据的绝对平均偏差

3 讨论

因SRL的有效治疗浓度范围较低4～10 μg/L，因此SRL的测定方法必须考虑到检测灵敏度与分离效果的问题。目前微粒免疫测定法(MEIA)和高效液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)常用来测定西罗莫司血药浓度，尽管HPLC-MS/MS分离能力好、高灵敏度且快速的仪器优势，但仪器昂贵的价格亦限制了其应用的普遍性，而在进行有效的样品预处理后，选择HPLC-MS进行检测，同样可以达到HPLC-MS/MS的检测灵敏度。故本文选择HPLC-MS法对西罗莫司的血药浓度进行了测定。

西罗莫司吸收入血后，95%分布于红细胞内，少部分与血浆脂蛋白结合［7］，因此测定西罗莫司 的血药浓度需用全血。血样的预处理先必须充分破坏红细胞，并沉淀蛋白，使西罗莫司从中分离出来，便于提取，随后还须将全血中的各种内源性杂质进行去除，以避免干扰西罗莫司的测定。固相萃取办法虽高效、可靠，但成本过高;而直接沉淀蛋白法虽然简便，但提取物中内源性物质较多，基质效应较高，因此在样品预处理方法的建立阶段，作者参考国内外同行的已报道方法［6，8］，并根据实验室现有条件，决定采用液液萃取方式处理样品，同时选择较易获取的达那唑作为内标，以提高本方法的通用性。作者对流动性的配比、色谱条件、质谱条件也进行了不断优化，最终确定的流动相、样品处理方法与质谱条件，进一步提高了本方法的灵敏度。

本研究还比较分析了MEIA与HPLC-MS两种方法测定结果的差异，并给出两种方法之间转换的定量关系，方便临床医生对TDM的结果解读;同时建立测定全血西罗莫司浓度的LC-MS法，可用于临床西罗莫司的浓度监测。体内西罗莫司主要经肝微粒体细胞色素P450酶系代谢为具有结构相似的去甲基化、羟基化成无免疫抑制活性的产物，而临床药理学活性主要由西罗莫司母药产生［9］。MEIA法是非特异性的，可与代谢产物发生交叉反应，与专门针对母体分子的LC-MS检测法相比，交叉干扰能够导致测定结果产生固定的正偏差［10］。本研究结果显示，MEIA法测定相对于LC-MS测定值明显偏高，与西罗莫司体内代谢特征及两种测定方法的原理相符合。

因此本文建立的LC-MS法测定肾移植术后患者西罗莫司血药浓度快速、准确、灵敏、选择性高，与Abbott IMx测定西罗莫司的免疫分析法比较均有较好的相关性，但LC-MS法能避免免疫分析方法中交叉免疫所造成的测定值偏高，更适用于临床对西罗莫司的血药浓度监测，尤其适用于肾移植术后以西罗莫司作为辅助用药时，西罗莫司血药浓度较低者的含量测定。

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Determination of blood concentrations of sirolimus in patients after renal transplantation

ZOU Jing，XIAO Hong-tao，LI Jin-qi，SHI Jian-you，WANG Ting (Department of Pharmacy，Sichuan Academy of Medical Science ＆ Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu 610072，China)

Objective To develop a HPLC-MS method for determination of blood sirolimus(SRL)concentrations in patients after renal transplantation．MethodsWe selected 20 patients who

a triple immunotherapy of FK506/CsA+Sirolimus+glucocorticoids after rental transplantation．The whole blood samples were collected．To determine the concentrations of SRL，danazol was used as the internal standard(IS)，and SRL and IS were separated on a Zorbax SB-C18 Narrow Bore RR(100 × 2.1 mm，3.5 μm)with a mobile phase containing H2O-acetonitrile-methanol(27:45:28，v/v)at a flow rate of 0.2 ml/min and temperature of the column is 60 ℃following protein precipitation and a simple two-step liquid-liquid extraction procedure．The mass spectrometer was operated in the positive ion mode，and selective ion monitors(SIM)were at m/z 936.76(［M+Na］+)for SRL and 338.26(［M+H］+)for internal stand-ard，respectively．At the same time，a microparticle enzyme immunoassay(MEIA)was also used to determine blood SRL concentrations．The consistency of results by the HPLC-MS method MEIA was analyzed．ResultsCalibration curves were linear(r=0.9992)between 0.2 and 100 μg/L of SRL and the sensitivity was 0.2 μg/L．Intraday and inter-day precision was less than 6%．Analytical recovery ranged from 92.93%to 102.98%．The correlation coefficient of the two methods was 0.979(P＜0.05)suggesting a close correlation between the two methods(n=20) ．An average deviation of the two methods was 1.4 μg/L when blood SRL concentrations ranging from 1.9 to 11.1 μg/L．ConclusionThe HPLC-MS method described herein had been successfully applied for TDM in adult renal transplant recipients due to its low limits of quantification and stability．There is a correlation between the HPLC-MS and MEIA in determination of blood RSL concentrations．However，the average concentration values of the same sample are higher using MEIA when compared to HPLC-MS method．

Sirolimus;Danazol;HPLC-MS;TDM;MEIA

R965

A

1672-6170(2017)04-0036-05

2017-02-03;

2017-04-03)

2015年四川省人民医院青年基金立项资助项目(编号:2015QN05)