阴道分泌物念珠菌感染三种检测方法比较分析

林开秀，阮艳秋

(1．四川省自贡市中医医院检验科，四川 自贡 643010;2．四川省自贡市第一人民医院检验科，四川 自贡 643000)

阴道分泌物念珠菌感染三种检测方法比较分析

林开秀1，阮艳秋2

(1．四川省自贡市中医医院检验科，四川 自贡 643010;2．四川省自贡市第一人民医院检验科，四川 自贡 643000)

目的 探讨三种检测方法对阴道分泌物真菌检测结果的差异。方法收集镜检阴道分泌物真菌阳性和阴性标本各200例，用PCR技术鉴定其念珠菌类型，再随机选择荧光PCR核酸检测结果阳性标本30例进行真菌微生物培养，验证分型结果的正确率。结果常规镜检阳性200例，荧光PCR核酸检测鉴定阳性189例，其中白色念珠菌157例(78.5%)，光滑假丝酵母菌24例(12%)，热带假丝酵母菌6例(3%)，白念合并光滑酵母菌2例(1%)，其他真菌11例(5.5%)。常规镜检阴性200例，荧光PCR核酸检测鉴定阳性58例，其中白色念珠菌50例，光滑假丝酵母菌6例，热带假丝酵母菌2例;随机选择荧光PCR核酸检测结果阳性标本30例真菌培养结果吻合率97%。结论门诊常规检验中，真菌涂片镜检应为首选。对于门诊镜检阴性而又有临床症状的患者，建议进行分子生物学基因鉴定。镜检和分子生物学方法可以相互补充，但应以分子生物学方法为标准。

阴道分泌物;真菌性阴道炎;荧光PCR核酸检测;白色念珠菌;光滑念珠菌;热带念珠菌

阴道炎是妇科病的常见病之一，可由念珠菌、阴道细菌、阴道滴虫等不同原因引起，其中根据Ries和Rajalakshmi报道，由念珠菌引起的阴道炎占阴道炎总数的20%～45%，细菌引起的阴道炎占阴道炎总数的30%～50%，阴道滴虫感染占10%～30%，混合感染占 15% ～20%［1，2］。据 Nwokolo 报道，估计有75%的女性一生中至少经历过一次念珠菌性阴道炎发作［3］。随着广谱抗生素的使用，以及免疫功能低下患者的增加，女性患念珠菌性阴道炎的患病率也在增加［4，5］。目前，阴道分泌物真菌检查主要通过用生理盐水拭子取阴道分泌物涂片镜检而得。但有时患者临床症状与镜检结果不符，有可能误导临床医生作出准确判断。而阴道分泌物真菌培养鉴定结果至少5～7天才能出具完整的培养报告，对于临床门诊患者治疗的及时性大打折扣，因此，亟需将分子扩增技术应用于检测和鉴定真菌性阴道炎。荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)核酸扩增技术作为一项先进的分子生物学检测方法，已广泛应用于微生物的快速准确检验中［6］。为此，我们收集400份门诊常规镜检阴道分泌物进行荧光PCR核酸检测基因分型和CHROMAgar念珠菌显色培养基培养分型，并将三者的结果进行比较分析，了解真菌性阴道炎感染常见的真菌类型，并探讨念珠菌性阴道炎快速鉴定的分型的实验方法。

1 对象与方法

1.1 研究对象选择2015～2016年在自贡市中医医院就诊阴道炎患者的阴道分泌物，常规镜检真菌阳性(找到典型芽孢和假菌丝者，或白细胞较多可疑者)标本200例，同时选择镜检霉菌阴性(白细胞较多，细菌阴性)的标本200例。阴道分泌物样本由本院妇产科医生采集，常规消毒患者外阴部后暴露宫颈，用无菌棉拭子插入宫颈内1～2 cm处旋转2～3周，停留片刻后取出含柱状上皮细胞的标本，放入含2 ml生理盐水的采样管后密封，立即送检。

1.2 仪器与试剂①主要仪器:高速低温离心机(贝克曼 Microfuge 22R)，恒温金属浴(杭州博日HB-100)，荧光定量PCR仪(ABI 7500序列检测分析仪)。②试剂:白色念珠菌、光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌核酸检测试剂盒均采用泰普生物科学(TIB)提供的试剂。CHROMAgar念珠菌显色培养基购置于广州益满生物科技公司。

1.3 试验方法①荧光PCR核酸检测:按照试剂说明书要求进行阴道分泌物DNA提取，并分别加入5 μl于已配制好的白色念珠菌、光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌核酸检特异性Taqman探针PCR反应液管中，对分泌物中的DNA片段进行检测。实验时严格按照SOP文件操作，分析数据，得出结果并上机。②常规镜检法:按照《全国临床检验操作规程(第4版)》的规范要求，将阴道分泌物涂抹于滴有生理盐水的载玻片上，置于显微镜下进行阴道分泌物常规检查，滴加5%NaOH两滴，观察有无霉菌孢子和(或)假菌丝，若观察到为阳性结果。③CHROMAgar念珠菌显色培养基培养鉴定:取30份荧光PCR核酸检测阳性的样本接种于沙保罗培养基培养 24～48小时后，挑单个菌落，接种于CHROMAgar念珠菌显色培养基上35℃培养24～48小时，根据颜色变化进行结果判定。

1.4 统计学方法采用SPSS 16.0统计软件处理数据。计数资料比较采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 常规镜检与荧光PCR核酸检测法检测结果比较有58例镜检阴性而荧光PCR核酸检测为阳性;11例镜检阳性而荧光PCR核酸检测为阴性。两种方法检测结果比较，差异有统计学意义(χ2=181.64，P ＜ 0.05)。见表1。

表1 常规镜检与荧光PCR核酸检测法检测结果比较 (n)

2.2 荧光PCR核酸检测真菌鉴定结果在200例常规镜检阳性的标本中，通过PCR核酸扩增检测得到引起真菌性阴道炎的真菌，白色念珠菌157例(78.5%)，光滑假丝酵母菌24例(12%)，热带假丝酵母菌6例(3%)，白色念珠菌合并光滑假丝酵母菌2例(1%)，其他真菌11例(5.5%)。常规镜检阴性200例，荧光PCR核酸检测鉴定阳性共计58例，其中白色念珠菌50例(86.2%)，光滑假丝酵母菌6例(10.3%)，热带假丝酵母菌2例(3.5%);可见真菌性阴道炎主要致病菌为白色念珠菌。

2.3 荧光PCR核酸检测与CHROMAgar快速显色法真菌分型结果比较30份样本中，有1份样本经荧光PCR核酸检测法测出为光滑念珠菌感染而CHROMAgar快速显色法未鉴定出，两种方法检验结果差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表2 荧光PCR和CHROMAgar快速显色法检测结果比较 (n)

3 讨论

目前，临床上由真菌引起的阴道炎称为念珠菌性阴道炎或霉菌性阴道炎，是一种困扰女性的常见的妇科疾病［7］。由寄生于肠道的假丝酵母菌(又称念珠菌)感染所致。据统计，念珠菌属感染已成为引起阴道感染的第二大病因，发病仅次于细菌性阴道炎［8］。典型的阴道分泌物呈白色黏稠厚豆渣样，涂片在显微镜下易找到孢子和假菌丝，结合临床表现，不难诊断。但有些病例临床症状与镜检不符，本研究有58例涂片检查阴性样本，在改用荧光PCR核酸检测方法后，得到了阳性结果，这说明常规镜检可能会导致部分真菌性阴道炎患者漏检，故对于有临床症状而镜检未查见真菌的患者，应通过PCR核酸扩增或经过真菌培养进行诊断。

近年来，随着抗真菌药物的临床应用，特别是耐药菌株的出现，念珠菌阴道炎的致病菌菌谱发生了较大的变化。这些念珠菌使用传统方法鉴别比较困难且耗时，因此有必要将念珠菌阴道炎的念珠菌菌种进行快速有效区分。本研究发现白念珠菌是引起念珠菌性阴道炎的主要菌种(占78.5%)，光滑念珠菌次之(占24%)，这与Martens报道的数据相近［9］。目前念珠菌阴道炎诊断的检测方法主要还是显微镜镜检结合微生物真菌培养，CHROMAgar快速显色法可用于念珠菌分离和鉴定，其优点是使用方便，缺点是且检查过程较为费时，并且手工通过沙堡培养基培养，容易遗漏对念珠菌的诊断［10］。本研究采用荧光PCR核酸检测直接将阴道炎分泌物提取DNA进行检测，与CHROMAgar显色培养法对照，检测结果差异无统计学意义，从而证明了PCR方法的准确性。而PCR核酸扩增检测不使用菌落培养，节省念珠菌培养所需的1～2天时间，并且可一次鉴定出常见的致病念珠菌(白念珠菌和光滑念珠菌、热带念珠菌等菌种)，从而有利于显著缩短诊断周期，节约时间并能准确地诊断念珠菌阴道炎。这对于减轻患者痛苦，提高治疗效果起到十分重要的作用，将会为念珠菌的快速鉴别诊断赢得时间，具有很重要的实用性。

本研究中有11例样本镜检阳性而荧光PCR核酸检测却为阴性，经分析标本来源及检测方法，可能是由于该11例样本所感染的真菌并非本研究PCR检测的三种真菌，使得镜检和PCR核酸扩增检测结果不一致，因此，两种方法结果可以互为补充。

本研究中有2例样本查出白色念珠菌和光滑念珠菌混合感染，原因可能为:①患者的确为两种念珠菌混合感染;念珠菌本是人体正常菌群之一，但其与阴道内其他正常菌相互制约的平衡被打破，可能导致阴道念珠菌病的发生［7］。②样本污染了白色念珠菌或光滑念珠菌。故应结合患者的具体病史和临床症状和体征进行分析，必要时重新采样进行。

［1］Ries AJ．Treatment of vaginal infections:candidiasis，bacterial vaginosis，and trichomoniasis［J］．J Am Pharm Assoc(Wash)，1997，37(5):563-569．

［2］Rajalakshmi R，Kalaivani S．Prevalence of asymptomatic infections in sexually transmitted diseases attendees diagnosed with bacterial vaginosis，vaginal candidiasis，and trichomoniasis［J］．Indian J Sex Transm Dis，2016，37(2):139-142．

［3］Nwokolo NC，Boag FC．Chronic vaginal candidiasis．Management in the postmenopausal patient［J］．Drugs Aging，2000，16(5):335-339．

［4］Gould D．Diagnosis，prevention and treatment of fungal infections［J］．Nurs Stand，2011，25(33):38-48．

［5］Mulu W，Yimer M，Zenebe Y，et al．Common causes of vaginal infections and antibiotic susceptibility of aerobic bacterial isolates in women of reproductive age attending at Felegehiwot Referral Hospital，Ethiopia:a cross sectional study［J］．BMC Womens Health，2015，15:42．

［6］van de Wijgert JH，Borgdorff H，Verhelst R，et al．The vaginal microbiota:what have we learned after a decade of molecular characterization［J］．PLoS One，2014，9(8):105998．

［7］Seider K，Brunke S，Schild L，et al．The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation［J］．J Immunol，2014，187(6):3072-3086．

［8］毕红琳，徐升强．医院念珠感染的流行病学调查［J］．数理医药学杂志，2011，24(2):203-204．

［9］Martens MG，Hoffman P，El-Zaatari M．Fungal species changes in the female genital tract［J］．J Low Genit Tract Dis，2004，8(1):21-24．

［10］Fornari G，Vicente VA，Gomes RR，et al．Susceptibility and molecular characterization of Candida species from patients with vulvovaginitis［J］．Braz J Microbiol，2015，47(2):373-380．

Comparative analysis of three-types of methods for detection of vaginal Candida infection

LIN Kai-xiu1，RUAN Yan-qiu2(1．Clinical Laboratory，Zigong Traditional Chinese Medicine Hospital，Zigong 643010，China;2．Clinical Laboratory，Zigong First People's Hospital，Zigong 643000，China)

RUAN Yan-qiu

Objective To compare the differences in detection of Candida infection in vaginal secretion by using 3 types of methods．MethodsWe collected 200 Candida positive and 200 negative vaginal secretion specimens from routine microscopic examination，respectively．The Candida types were identified with PCR technique．Then，we randomly selected 30 PCR positive samples for fungal microorganisms'culture to demonstrate the accuracy of classification results．ResultsOf the 200 microscopic positive samples，189 samples were identified as positive by using fluorescence PCR method．In these of fluorescence PCR positive samples，157 were Candida albicans(78.5%)，24 were Smooth candida yeast(12%)，6 were Candida tropicalis(3%)and 2 samples were combined Candida albicans and Smooth candida yeast．There were 11 cases with other fungus(5.5%)．Of the 200 microscopy negative samples，58 sampleswere identified as positive in which 50 were Candida albicans，6 were Smooth candida yeast and 2 were Candida tropicalis．In the randomly selection of 30 fluorescent PCR positive samples，the coincidence rate with fungal culture results was 97%．ConclusionIn the routine clinic examination，microscopic examination of fungal pictures should be the first choice．At the same time，for outpatient with microscopy negative but has clinical symptoms，it is recommended to do molecular biology gene identification．Microscopic examination and molecular biological methods can be complementary but molecular method should be used as standard．

Vaginal secretions;Fungal vaginitis;Fluorescence PCR nucleic acid detection;Candida albicans;Candida glabrata;Candida tropicalis

R37;R446.5

A

1672-6170(2017)04-0212-03

2017-01-12;

2017-03-24)

阮艳秋