曲美他嗪通过抑制MicroRNA-423-5p凋亡信号通路保护H2O2引起的心肌缺血再灌注损伤

罗 鹏，张 维

(四川省医学科学院·四川省人民医院 a．心血管内科，b．老年医学科，四川 成都 610072)

曲美他嗪通过抑制MicroRNA-423-5p凋亡信号通路保护H2O2引起的心肌缺血再灌注损伤

罗 鹏a，张 维b

(四川省医学科学院·四川省人民医院 a．心血管内科，b．老年医学科，四川 成都 610072)

目的 探讨曲美他嗪通过microRNA-423-5p(miR-423-5p)凋亡信号通路对H2O2引起的缺血再灌注损伤保护作用的分子生物学机制。方法培养小鼠心肌细胞，先以CCK-8和TUNEL检测对比观察H2O2对心肌细胞活性及凋亡的影响，同时以RT-q-PCR定量检测各组心肌细胞内miR-423-5p表达的情况。再通过质粒转染细胞上调和下调miR-423-5p的表达，观察心肌细胞的活性及凋亡情况。最后在H2O2诱导组中加入不同浓度曲美他嗪，检测miR-423-5p和下游通道的表达以及细胞活性和凋亡情况。结果以H2O2处理小鼠心肌细胞会上调miR-423-5p的表达，同时降低心肌细胞的活性并引起凋亡(p＜0.01)。以质粒转染心肌细胞提高miR-423-5p表达可以降低心肌细胞活性并引发凋亡;降低miR-423-5p表达则可以减轻H2O2引起的细胞活性降低及凋亡效应(p＜0.01)。在H2O2处理组中加入曲美他嗪可以下调miR-423-5p的表达，同时减轻心肌细胞活性降低及凋亡比例(p＜0.01)。结论H2O2通过上调心肌细胞中的miR-423-5p表达诱导心肌细胞活性降低并引起凋亡，曲美他嗪通过抑制该miR的表达从而减少H2O2对心肌细胞活性的损伤并减少凋亡。

缺血再灌注损伤;microRNA-423-5p;H2O2;曲美他嗪

机体组织器官正常代谢有赖于良好的血液循环。各种原因造成的组织缺血，常常造成缺血性损伤。但在一定条件下恢复血液再灌注后，部分细胞功能代谢障碍及结构破坏不但未减轻反而加重，这种血液再灌注后缺血性损伤进一步加重的现象称为缺血再灌注损伤。自由基对细胞的损害是造成缺血再灌注损伤的主要原因。H2O2是一种常见的氧自由基。H2O2在细胞内的积累与心肌缺血再灌注损伤有明确的关系［1］。MicroRNA(miR)是一类内生的、长度为20～24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。其调节方式主要是通过上调或下调表达量来完成的。本研究以不同浓度、时间强度的H2O2处理小鼠心肌细胞，观察细胞活性和凋亡情况，同时测量细胞内miR-423-5p的表达水平。进而通过调节该miR的表达来模拟或保护此种细胞损伤。最后观察曲美他嗪对于H2O2诱导的细胞损伤的保护作用与该miR的关系。以期揭示曲美他嗪对缺血再灌注损伤的保护作用的分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1 材料实验用小鼠心肌细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(上海)。曲美他嗪由施维雅公司(天津)提供。细胞培养所用试剂及RNA抽提、cDNA合成和q-PCR试剂盒均购买于ThermoFisherScientific公司(USA)。MicroRNA-423-5p、microRNA-423-5p-mimic质粒及 pMIR-REPORT载体购买AmbionLifeTechnologies公司(USA)。质粒扩增所用DH5α大肠杆菌菌株购买于Genewiz公司(美国)。细胞活性测定所用 CellCountingKit-8(CCK-8)检测套件购买于BeyotimeInstituteofBiotechnology公司(美国)。细胞转染用FuGENE®HD试剂盒均购买于Roche Diagnostics公司(USA)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和处理 所有的细胞培养都在37℃含5%CO2的湿润空气中以含10%胎牛血清的DMEM进行。细胞转染依照FuGENE®HD转染套件依照操作说明书完成。转染操作时心肌细胞以2×105cell/孔的浓度种入6孔细胞培养板，培养24 h达到70%～80%融合度。其后，取2 μg质粒，以无血清的培养液，稀释到 100 μl，再加入 5 μlFuGENE®HD转染液，常温反应15 min后加入6孔板后使用。H2O2处理时取70%～80%融合度的细胞，分别加入0、0.1、0.2、0.4 和 0.8 mM 的 H2O2，分别培养 12、24和48 h后行后续实验。曲美他嗪处理时待细胞培养至70%～80%融合度，分别加入0、10、20、40和80 μM的曲美他嗪，培养心肌细胞24小时后行后续实验。

1.2.2 载体构建 将miR-423-5p和miR-423-5pmimic质粒以DH5α大肠杆菌菌株扩增并提取，存于-20℃冰箱内备用。质粒浓度以ThermoND 2000分光光度计(ThermoFisherScientific，Inc．)测定。

1.2.3 细胞活性检测 细胞活性以CCK-8测定套件测定，选定波长450 nm，每标本测定3次取平均值。

1.2.4 RT-q-PCR 依照操作手册以TRIzol裂解液提取总RNA。采用cDNA合成试剂盒将RNA反转录为cDNA，然后进行RT-PCR操作。结果以Bio-RadCFX96 thermalcycler(Bio-Rad Laboratories，Inc．)检测。

1.2.5 细胞凋亡检测 使用DeadEndTMFluorometricTUNEL系统(Progega)，以操作说明书流程检测心肌细胞中的凋亡细胞。TUNEL-阳性的细胞在DTX500荧光显微镜(Nikon)下可见细胞核有暗绿色荧光显现，随机选取5个视野取平均值进行相对计数。

1.2.6 MiR-423-5p 介导H2O2引起细胞活性降低及凋亡的检验构建并引入miR-423-5p和miR-423-5p-mimic两种质粒(后者可以中和前者的活性)，并以miR-Control做空白对照进行检验。以RT-q-PCR检验以下各组心肌细胞活性，同时以TUNEL套件检验上述各组心肌细胞的凋亡情况:空白对照组、独立H2O2(0.4 mM)处理组、H2O2(0.4 mM)联合miRControl组、H2O2联合miR-423-5p-mimic质粒组以及独立miR-423-5p质粒组。

1.3 统计学方法使用SPSS 13.0统计学软件包进行数据处理，计量资料以均数±标准差表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H2O2降低心肌细胞活性并诱导miR-423-5p的表达以H2O2(0.4mM)处理12 h后心肌细胞活性明显降低，继续延长处理时间到24～48 h可以进一步降低心肌细胞活性;以H2O2(0.4 mM)处理12 h后心肌细胞中miR-423-5p的表达明显上调，继续延长处理时间到24～48 h后其表达会进一步上调(表1)。以0.1 mM浓度的H2O2处理心肌细胞24 h不会明显降低其活性，但以0.2、0.4和0.8 mM浓度的H2O2处理则会明显抑制心肌细胞的活性;同样处理24小时，以0.2、0.4和0.8 mM浓度的H2O2处理后的心肌细胞中miR-423-5p的表达也是递增的，而0.1 mM浓度的H2O2对该miR的表达影响不明显(表2)。

表1 相同浓度H2O2(0.4 mM)不同时间长度处理心肌细胞后细胞活力及miR-423-5p的表达情况

表2 以不同浓度H2O2处理相同时间长度(24小时)处理心肌细胞后相对细胞活力对比

2.2 MiR-423-5p介导了H2O2诱导的心肌细胞活性降低和凋亡以miR-423-5p质粒处理心肌细胞，可以将细胞内miR-423-5p的表达水平提高到对照组的8.12±0.43倍(P＜0.01);而以 miR-423-5p-mimic质粒处理，则会将其降低至对照组的0.26±0.03倍(P＜0.01)。单独以H2O2处理或单独以miR-423-5p质粒转染均可以明显降低心肌细胞活性;H2O2联合miR-423-5p-mimic质粒处理组对比对照组无明显差异;以H2O2处理或以miR-423-5p质粒导致过表达均会明显增加心肌细胞的凋亡;以H2O2处理再以miR-423-5p-mimic抑制其表达则可以明显减少凋亡情况(表3，图1)。

表3 以不同方式处理心肌细胞后相对细胞活力及miR-423-5p的表达情况

图1 不同质粒转染H2O2处理后心肌细胞TUNEL照片(荧光标识存活细胞)

2.3 曲美他嗪通过抑制miR-423-5p的表达减轻H2O2诱导的心肌细胞活性降低及凋亡以H2O2(0.4 mM)分别联合 0、10、20、40 和 80 μM 的曲美他嗪(TMZ，下同)处理心肌细胞48小时后，以RT-q-PCR检验miR-423-5p的表达水平。与0 μM组比较，10、20 μM 曲美他嗪组 miR-423-5p表达明显降低，但继续提高浓度不能进一步降低该miR的表达(表4)。以TUNEL检验上述各组心肌细胞的凋亡情况，以曲美他嗪抑制miR-423-5p的表达可以明显减少心肌细胞的凋亡情况(表4，图2)。

表4 以不同方式处理心肌细胞48 h后miR-423-5p的表达情况及细胞凋亡指数

图2 不同浓度曲美他嗪干预H2O2处理后心肌细胞的TUNEL照片(荧光标识存活细胞)

3 讨论

已有的大量研究表明，心肌活性降低和凋亡在缺血性心脏病、心力衰竭、心律失常等多种心脏疾患中扮演着重要的角色。在心肌细胞缺血再灌注损伤中，细胞中产生并积累的H2O2等自由基导致线粒体功能障碍、DNA损伤等多种细胞损害，引起细胞活性降低及凋亡，并最终导致心力衰竭和心律失常等后果［4］。为减轻此种损伤，保护心脏功能，研究人员进行了大量的实验。

基于自由基损伤机制，我们有理由相信，可以直接对抗自由基的抗氧化剂可以在一定程度上保护心肌细胞，减轻缺血再灌注损伤。已有研究证实包括维生素C的一些抗氧化剂可以减轻过氧化物诱导的缺血再灌注损伤情况，保护心脏的功能［5］。另研究显示，曲美他嗪等心肌代谢治疗药物同样可以减轻心肌缺血再灌注损伤，改善预后［6］。但此种保护的机制明显不同于抗氧化剂，一直未被完全明确。

近年发现，miR表达的改变见于各种心脏疾病中，除提供了新的可能的检验指标外，还提供了可能的治疗靶点。miR-423-5p是其中较为受到关注的一个。目前已发现，miR-423-5p在慢性心力衰竭患者的循环中表达明显上调，并与预后有关［7］。曲美他嗪可以改善缺血所致心力衰竭的预后［8］。

本实验发现，H2O2可以诱导心肌细胞上调miR-423-5p的表达，且此种诱导呈时间和浓度依赖。此种表达的上调会降低心肌细胞活性，并诱导其凋亡。以miR-423-5p-mimic沉默miR-423-5p的表达可以抑制心肌细胞活性的降低，并减少凋亡。既往已有实验提示 miR-423-5p的直接下游靶点 OGT、p-AMPK和26 s蛋白酶体都与凋亡相关［3］。部分揭示了自由基诱导心肌细胞凋亡的信号通路。

实验同时发现，曲美他嗪可以减少H2O2诱导的miR-423-5p表达上调，在一定程度上阻断miR-423-5p、OGT、p-AMPK和26 s蛋白酶体信号通路。从而减轻H2O2诱导的心肌细胞活性降低和凋亡，保护受到缺血再灌注损伤心肌。可以部分解释以曲美他嗪进行心肌代谢治疗为何可以减轻缺血再灌注损伤并保护心脏功能。

H2O2可以诱导心肌细胞上调miR-423-5p的表达，且此种诱导呈时间和浓度依赖，下调或者沉默该miR可以减少H2O2诱导的心肌细胞凋亡，一定程度上减轻自由基导致的心肌缺血再灌注损伤。这个结果提示 miR-423-5p可能可以作为一个有效的治疗靶点来减轻心肌缺血再灌注损伤。

［1］Khurana S，Hollingsworth A，Piche M，et al．Antiapoptotic actions of methyl gallate on neonatal rat cardiac myocytes exposed to H2O2［J］．Oxid Med Cell Longev，2014，2014:657512

［2］Luo P，He T，Jiang R，et al．MicroRNA-423-5p targets O-GlcNAc transferase to induce apoptosis in cardiomyocytes［J］．Mol Med Rep，2015，12(1):1163-1168．

［3］Soukoulis V，Boden WE，Smith SC Jr，et al．Non-antithrombotic medical options in acute coronary syndromes:old agents and new lines on the horizon［J］．Circ Res，2014，6，114(12):1944-1958．

［4］Peng YW，Buller CL，Charpie JR．Impact of N-acetylcysteine on neonatal cardiomyocyte ischemia-reperfusion injury ［J］．Pediatr Res，2011，70(1):61-66．

［5］Kane AD，Herrera EA，Camm EJ，et al．Vitamin C prevents intrauterine programming of in vivo cardio-vascular dysfunction in the rat［J］．Circ J，2013，77(10):2604-2611．

［6］蒋刘霞，傅国胜，寿晔，等．曲美他嗪对PCI术相关心肌缺血再灌注损伤及预后的影响［J］．中国现代医生，2014，52(19):4-7．

［7］Tijsen AJ，Creemers EE，Moerland PD，et al．MiR423?5p as a circulating biomarker for heart failure［J］．Circ Res，2010，2，106(6):1035-1039．

［8］刘南朝，周有华．曲美他嗪联合瑞舒伐他汀对老年缺血性心肌病心力衰竭患者心功能及N-脑钠肽前体的影响［J］．实用医院临床杂志，2015，12(3):124-126．

Trimetazidine targets microRNA-423-5p signal pathway to protect cardiomyocytes from H2O2-induced apoptosis in ischemic reperfusion injuries

LUO Penga，ZHANG Weib(a．Department of Cardiology，b．Geriatric Medicine，Sichuan Academy of Medical Sciences ＆ Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu，610072，China)

ZHANG Wei

Objective To investigate the molecular biological mechanism of the protective effect of trimetazidine against H2O2-induced apoptosis in ischemic reperfusion injuries．MethodsMouse cardiomyocytes were cultured．The effect of H2O2on cardiomyocytic activity and apoptosis was observed by detection of CCK-8 and TUNEL．Meanwhile，the expression of microRNA-423-5p(miR-423-5p)in myocardiocytes following exposure to H2O2was determined by using RT-q-PCR analysis．Further，up-or down-regulation of miR-423-5p were carried out through plasmid transfection to cells to observe the cardiomyocytic activity and apoptosis．Finally，expression of miR-423-5p and downstream as well as cardiomyocytic activity and apoptosis in the H2O2induce group after addition of various concentrations of trimetazidine．ResultsH2O2increased the expressions of miR-423-5p，decreased myocardiocytic activity and induced cell apoptosis(P ＜ 0.01)．The plasmid transfection to myocardiocytes increased the expression of microRNA-423-5p that decreased myocardiocytic activity and induced cell apoptosis．However，the decreased expressions of miR-423-5p could reduce the effect of H2O2(P ＜0.01)．Trimetazidine could decrease the expression of miR-423-5p and relieve the H2O2-induced decrease of myocardiocytic activity and apoptosis(P ＜ 0.01)．ConclusionH2O2induces the myocardial cell activity and apoptosis through up-regulating the expression of microRNA-423-5p．Trimetazidine targets microRNA-423-5p signal pathway to protect cardiomyocytes from H2O2-induced apoptosis in ischemic reperfusion injuries．

Ischemic reperfusion;MicroRNA-423-5p;H2O2;Trimetazidine

R541.4

A

1672-6170(2017)04-0026-04

2016-12-09;

2017-05-03)

张 维