大黄素在体外诱导人肝癌Hep3b细胞凋亡的作用及机制

倪 华 王 钦

(南通大学附属医院药学部，江苏 南通 226001)



大黄素在体外诱导人肝癌Hep3b细胞凋亡的作用及机制

倪 华 王 钦

(南通大学附属医院药学部，江苏 南通 226001)

目的 了解大黄素在体外诱导人肝癌Hep3b细胞凋亡的作用及机制。方法 采用MTT法测定不同浓度大黄素对人肝癌Hep3b细胞的抑制作用，不加大黄素作为对照组；采用流式细胞仪检测大黄素作用后的Hep3b细胞的增殖周期，计算细胞增殖指数(PI)；Western印迹法检测Hep3b细胞凋亡相关蛋白AKT、Bcl-2、p-AKT和酶切caspase-3的相对表达量。结果 1、5、25、125 μmol/L大黄素作用24 h后的OD值均低于对照组(t=1.694、6.129、13.400、34.739，P均<0.05)；随着大黄素浓度的升高，它对Hep3b细胞的抑制率呈上升趋势；作用24 h时，大黄素对Hep3b细胞的半抑制浓度(IC50)为21.08 μmol/L。25、125 μmol/L大黄素作用24、36 h后，Hep3b细胞的G0/G1期比例增高(P<0.05)，S期比例、PI降低(P<0.05)，因而表现出浓度、时间依赖性。大黄素作用时间增加后，抑制细胞凋亡的Bcl-2(24 h：t=2.610；36 h：t=5.713)、p-AKT蛋白(12 h：t=2.075，24 h：t=5.157；36 h：t=12.926)的表达量呈下降趋势(P均<0.05)，促进细胞凋亡的酶切caspase-3蛋白的表达量呈上升趋势(6、12、24、36 h：t=2.487、3.327、5.276、8.137，P均<0.05)。结论 大黄素在体外通过诱导细胞凋亡而抑制人肝癌Hep3b细胞的增殖，大黄素是通过AKT信号途径诱导Hep3b细胞凋亡。

大黄素；人肝癌Hep3b细胞；肝癌；抑制率；细胞凋亡

大黄是蓼科大黄属植物，是祖国传统中药材，用于疾病的治疗已有数千年历史，具有清湿热、攻积滞、凉血、泻火、解毒、祛瘀之功效，其主要化学成分是大黄素、大黄酚、大黄酸、番泻苷、大黄多糖等物质。其中大黄素是大黄最重要的活性成分，近年研究发现，大黄素具有一定的抗肿瘤活性，能明显抑制多种恶性肿瘤细胞的增殖过程，如肺癌、宫颈癌、白血病、肝癌等〔1～4〕。目前肝癌的主要治疗手段是化学治疗，但部分化疗药物的毒副作用明显，因而临床应用受限〔5，6〕。近年来，由中草药中提取有效抗肿瘤成分，并验证其抗肿瘤活性已成为新的研究热点，用此方法可开发新的高效低毒的抗肝癌药物，有利于老年肝癌患者的治疗。目前，已有大黄素对人肝癌细胞SMMC-7721和HepG2作用的相关研究报道〔7，8〕，但尚无大黄素对人肝癌Hep3b细胞生长的影响报道。因而本文探讨大黄素对人肝癌Hep3b细胞增殖的影响，进一步证实大黄素的抗肝癌药物活性。

1 材料和方法

1.1 细胞 人肝癌Hep3b细胞株，由苏州大学药学院提供，在含10%小牛血清、100 μg/ml链霉素、100 U/ml青霉素的RPMI-1640细胞培养液中，含有5%CO2、37℃恒温条件孵育24 h后传代。

1.2 试剂与仪器 大黄素(纯度>98%，西安丰足生物科技有限公司)；小牛血清(澳大利亚Selborne公司)；青霉素、链霉素(华北制药有限公司)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)(美国Sigma-Aldrich公司)；β-actin、AKT、Bcl-2、p-AKT、酶切caspase-3抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗鼠IgG、HRP标记山羊抗兔IgG(美国Santa Cruz公司)。IX83型倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)；DNM-9606型酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司)；Forma Steri-Cult型红外CO2恒温培养箱(美国Thermo公司)；FACSCalibur型全自动流式细胞仪(美国BD公司)；Micro Chemi型凝胶成像系统(以色列DNR公司)。

1.3 方法

1.3.1 大黄素溶液的配制 将5.0 mg大黄素超声溶解于1.0 ml的0.1%二甲基亚砜溶液(DMSO)中，再加入37.0 ml灭菌注射用水和0.25 ml 5 mol/L NaOH溶液，采用0.45 μm微孔滤膜过滤，制得浓度为500 μmol/L的大黄素标准溶液。实验时采用灭菌注射用水稀释至所需浓度即可。

1.3.2 大黄素对Hep3b细胞的抑制作用 将对数生长期Hep3b细胞稀释至1.0×104个/ml，接种至96孔板中，37℃恒温5%CO2环境中培养24 h。分别加入大黄素使成终浓度为1、5、25、125 μmol/L；对照组仅加入等量的培养基；另设置空白调零孔，不加细胞，仅加入培养基；每个药物浓度、对照组、空白调零孔均设8个复孔，实验重复3次。继续培养24 h后，在每孔中加15 μl 5.0 mg/ml标准浓度MTT，再培养3 h，采用磷酸盐缓冲液(PBS)反复洗涤细胞3次，在每孔中加100 μl DMSO并振荡20 min，采用酶标仪检测每孔在570 nm波长的吸光度(OD)值，计算抑制率(%)=〔1-(大黄素孔OD值-空白调零孔OD值)/(对照孔OD值-空白调零孔OD值)〕×100%。

1.3.3 Hep3b细胞周期 采用1、5、25、125 μmol/L大黄素作用并孵育12、24、36 h的细胞各1×105个，2 000 r/min离心8 min，弃去上清液，并采用PBS反复3次洗涤细胞，加4℃ 75%酒精溶液固定细胞并保持4℃ 12 h。2 000 r/min离心8 min得沉淀，加入PBS充分悬浮收集到的细胞，过400目筛网得滤液，2 000 r/min离心8 min得沉淀；再加适量RNaseA使成60 μg/ml溶液，37℃恒温下培养45 min，然后加碘化丙啶得终浓度50 μg/ml的溶液，4℃恒温下避光保存45 min。流式细胞仪测定Hep3b细胞的周期及其比例，并计算细胞增殖指数(PI)。

1.3.4 细胞凋亡相关蛋白的表达量 采用Western印迹进行检测。采用培养基稀释Hep3b细胞接种至6孔板内，细胞密度为1×105/孔，采用浓度为40 μmol/L的大黄素溶液处理Hep3b细胞0、6、12、24、36 h后回收细胞至离心管中，加入含苯甲基磺酰氟化物(PMSF)的细胞裂解液置冰袋上处理40 min，保持4℃温度，12 000 r/min连续离心25 min，取上清液。采用SDS-PAGE电泳法将上清液中的蛋白进行分离，转到硝酸纤维膜中，采用脱脂牛奶进行封闭，50 min后加入一抗(AKT、Bcl-2、p-AKT和酶切caspase-3)，保持4℃并缓慢振荡10 h。采用TBST缓冲液洗涤硝酸纤维膜，再加入经辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG，振荡60 min。再次用TBST缓冲液洗涤，采用增强化学发光法显色，以β-actin作为内参基因。

1.4 统计学方法 采用SPSS24.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 大黄素对Hep3b细胞抑制率的影响 浓度为1、5、25、125 μmol/L大黄素作用24 h后的OD值均明显低于不加药物的对照组(t=1.694、6.129、13.400、34.739，P均<0.05)；随着大黄素浓度的升高，它对Hep3b细胞的抑制率呈上升趋势；作用24 h时，大黄素对Hep3b细胞的半抑制浓度(IC50)为21.08 μmol/L，见表1。

2.2 各组Hep3b细胞的细胞周期与PI 与对照组比较，25、125 μmol/L大黄素作用24、36 h后，Hep3b细胞的S期比例、PI显著降低(P均<0.05)，而G0/G1期比例明显增高(P均<0.05)，因而表现出浓度、时间依赖性，见表2。

2.3 各组细胞凋亡相关蛋白的表达量 与对照组比较，大黄素作用时间增加后，抑制细胞凋亡的Bcl-2(24 h:t=2.610,36 h:t=5.713)、p-AKT蛋白(12 h:t=2.075,24 h:t=5.157,36 h:t=12.926)的表达量呈下降趋势(P均<0.05)，促进细胞凋亡的酶切caspase-3蛋白的表达量呈上升趋势(6 h：t=2.487，12 h:t=3.327,24 h:t=5.276,36 h:t=8.137，P均<0.05)，而AKT蛋白的表达量无统计学差异(P均>0.05)。这表明大黄素通过AKT信号途径发挥诱导Hep3b细胞凋亡的作用，见表3。

表1 大黄素对Hep3b细胞抑制率的影响

与对照级比较：1)P<0.05；与前一浓度大黄素组比较：2)P<0.05

表2 各组Hep3b细胞的细胞周期与

与对照级比较：1)P<0.05；与12 h比较：2)P<0.05

表3 各组细胞凋亡相关蛋白的表达量

与对照级比较：1)P<0.05

3 讨 论

大黄素由传统中药大黄、何首乌中提取，具有抗病毒、抗肿瘤、免疫抑制、抗微生物生长、利尿、解痉、止咳等药理作用〔9〕。文献报道大黄素对多种恶性肿瘤细胞具有明显的抑制与杀伤作用，如胃癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌细胞等，且抑制作用呈现一定的时间与剂量依赖性，但对人体正常细胞并没有细胞毒作用〔10～13〕。治疗肝癌的主要难点是癌细胞的增殖能力与抗凋亡能力明显强于人体正常细胞，且一般的化疗药物对正常细胞也有细胞毒作用〔14〕。因此，中药提取物大黄素与传统化疗药物相比，具有高效低毒的优点。

本研究结果表明，大黄素对Hep3b细胞的抑制作用是通过诱导细胞凋亡而体现出来的，这种诱导Hep3b细胞凋亡的作用同样具有浓度和时间依赖性。

PI3K/AKT信号转导通路在人肝癌细胞的增殖、分化及凋亡过程中均发挥着十分重要的作用〔15〕。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，它激活后会在质膜上产生第二信使PIP3；信号蛋白AKT位于细胞内，含有PH结构域；当PIP3、磷酸化依赖性蛋白(PDK)1、AKT结合后，能促使PDK1磷酸化AKT蛋白中的Ser 308氨基酸位点，从而AKT被激活；此外，PDK2还可磷酸化AKT蛋白中的Thr 473氨基酸位点而活化AKT蛋白。激活后的AKT蛋白又可以激活或抑制它的下游蛋白caspase-9、Bad、NF-κB等，实现调节肝癌细胞的生长、分化与凋亡过程。文献研究报道，大黄素能抑制PDK/AKT 信号通路而下调AKT蛋白的活性，然而不会直接影响AKT蛋白激酶的作用〔16〕。本研究结果表明，大黄素作用时间增加后，抑制细胞凋亡的Bcl-2、p-AKT蛋白的表达量呈下降趋势，促进细胞凋亡的酶切caspase-3蛋白的表达量呈上升趋势。这是由于大黄素作用后，磷酸化的AKT蛋白能调控多种下游蛋白酶切caspase-3、Bcl-2等，诱导Hep3b细胞凋亡，从而表现出明显的抗肝癌作用。

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〔2015-12-06修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

王 钦(1985-)，男，硕士，主管药师，主要从事医院制剂、药物基因组学研究。

倪 华(1964-)，女，主管药师，主要从事医院药学研究。

R285

A

1005-9202(2017)14-3434-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.023