miR-638对胃癌细胞侵袭和迁移的影响及其分子机制

王 钊 杨东海 彭林涛

(邢台市人民医院普外科，河北 邢台 054000)



miR-638对胃癌细胞侵袭和迁移的影响及其分子机制

王 钊 杨东海1彭林涛

(邢台市人民医院普外科，河北 邢台 054000)

目的 探讨miR-638是否可通过直接调控靶向性别决定区Y框蛋白(SOX)2抑制上皮-间质转化(EMT)相关通路从而抑制胃癌细胞的侵袭迁移。方法 qRT-PCR检测miR-638在100对胃癌组织及癌旁组织中的表达、检测miR-638在7株胃癌细胞系及1株正常胃黏膜细胞中的表达。Transwell和Wound Healing实验验证分别转染miR-638模拟物(miR-638 mimics)及其无关对照寡核苷酸序列(scramble)到胃癌细胞AGS中时对细胞的侵袭和迁移能力的影响。TargetScan软件预测miR-638的靶基因、将野生型或突变型SOX2的3'-UTR区域克隆到荧光素酶报告基因的下游(SOX2-wt或SOX2-mut)并分别与miR-638 mimics或scramble共转染，荧光素酶报告基因实验验证所预测的靶基因为SOX2，qRT-PCR和Western印迹分别检测转染miR-638 mimics和scramble后SOX2的mRNA和蛋白表达的及EMT相关蛋白表达。结果 miR-638在胃癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织，同时miR-638在胃癌细胞系中的表达水平也显著低于正常胃黏膜细胞系。转染miR-638后，胃癌细胞AGS的侵袭和迁移能力显著低于scramble组(P<0.05)。在共转染miR-638或scramble和SOX2-wt的两组中，共转染miR-638和SOX2-wt组的荧光素酶活性强度降低了约43.1%(P<0.05)。转染miR-638后，SOX2的mRNA和蛋白表达水平均显著下调；EMT相关的上皮标志物钙黏附蛋白E(E-cadherin)的表达显著增加，而EMT相关的间质标志物神经钙联素(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的表达则显著降低(P<0.05)。结论 miR-638可通过靶向调控SOX2而影响EMT，抑制胃癌细胞AGS的侵袭和迁移。

胃癌；miRNA-638；性别决定区Y框蛋白2；侵袭；迁移

MicroRNAs(miRNAs)是长度为19～25 nt的内源性非编码RNA分子，在动植物的基因表达调控中发挥十分重要的作用〔1〕。miRNAs可通过与其靶基因的3′-UTR区域(3′-非翻译区)结合，使mRNA降解或(和)抑制其翻译从而调控其表达〔2〕。miRNAs可参与细胞的增殖、分化、凋亡等多个过程。研究显示miRNAs与多种恶性肿瘤的发生或发展密切关联〔3〕。据报道，miR-638在多种恶性肿瘤组织及细胞系中表达下调，并与多种恶性肿瘤的增殖、迁移、复发或转移相关〔4〕。

处于中晚期的胃癌大多伴有胃癌细胞的转移，严重影响患者的治疗效果及预后〔5〕。据报道，肿瘤的侵袭迁移常与上皮-间充质转化(EMT)密切相关，即当肿瘤发生侵袭转移时，其上皮细胞通过特殊黏附复合体而连接，且间充质细胞逐渐失去细胞间黏附成为梭形细胞。常见的EMT相关的上皮标志物有钙黏附蛋白E(E-cadherin)，间质标志物有神经钙联素(N-cadherin)，波形蛋白(Vimentin)等〔6～8〕。EMT被认为是肿瘤发生侵袭迁移的中间阶段，检测EMT相关蛋白的变化可间接反映肿瘤细胞的侵袭转移状态〔9〕。有文献报道性别决定区Y框蛋白(SOX)2和EMT信号通路有密切关联〔10〕。本研究拟论证miR-638是否可通过抑制其靶基因SOX2而抑制EMT通路，并对胃癌细胞的侵袭迁移能力产生影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料 miR-638模拟物(miR-638 mimics)及其阴性对照scramble购于Ambion公司。兔抗人SOX2，β-actin，E-cadherin，N-cadherin和Vimentin抗体均购于CAT公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购于武汉博士德公司。突变型SOX2的3′-非翻译区(3′-UTR)的荧光素酶报告载体(SOX2-mut)和野生型SOX2的3′-UTR的荧光素酶报告载体(SOX2-wt)均由GeneCopoeia公司构建。双荧光素酶活性检测试剂盒购购于Promega公司，Lipofectamine 2000和Trizol试剂购于Invitrogen公司。蛋白提取试剂盒、增强化学发光法(ECL)试剂盒和BCA蛋白定量检测试剂盒均购于Thermo公司。Transwell小室购于BD公司。TaqMan miRNAs逆转录试剂盒(Life Technologies，UK)。

1.2 临床样本 选取2012年9月至2015年9月经邢台市人民医院病理科确诊并存档的100对胃癌组织及癌旁对照组织，病人的所有临床病理学数据被妥善保存且可随时查阅。所有过程遵从赫尔辛基宣言的标准，得到我院伦理委员会的支持。病例均签署了知情同意书，研究方案经我院伦理委员会批准。100例胃癌组织和癌旁对照组织均保存于液氮中用于提取RNA后检测胃癌组织及癌旁对照组织样本中miR-638的表达情况。

1.3 细胞培养 人胃癌细胞株MKN-28，MKN-45，BGC-823，MGC-803，AGS，SGC-7901和HGC-27以及人正常胃黏膜细胞GES-1均来源于中国科学院上海生命科学院生化细胞所。培养细胞于含10%胎牛血清(FBS，Gibco)和100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml链霉素(双抗，Invitrogen)的RPMI-1640培养基(Sigma)中，细胞放置于37℃，含5%CO2的细胞培养箱内孵育。后期用于提取细胞系RNA并检测各细胞系中miR-638的表达情况。

1.4 RNA提取 取液氮保存的胃癌组织和癌旁对照组织样品各100 mg，每份分别加入700 ml的Trizol试剂，充分研磨(细胞系总RNA的提取则每6孔板中加入100 μl Trizol，其余试剂则按比例递减)。室温放置5 min后加入140 ml氯仿，剧烈震荡15 s，室温放置5 min 12 000 r/min，4℃离心15 min，吸取上层液体到另一干净的EP管中，按0.5 ml异丙醇/ml Trizol的比例加入异丙醇混匀，室温放置10 min，离心去上清。1 ml 75%乙醇洗涤沉淀，转速7 500 r/min，4℃离心离心5 min，弃上清，室温干燥，加入30 μl无RNase双蒸水溶解，取1 μl测RNA浓度和纯度，剩余RNA立即放入-20℃保存备用。将分装出的1 μl总RNA用于浓度测定，紫外可见分光光度计(Thermo，Nanodrop 2000)测定A260/A280比值，以1 μl的RNAase-free水作空白校对测定，当测定值<3时可正常进行样本测定。RNA样本测定前简单离心，充分混匀后测定。当A260/A280在1.8～2.0之间时表示血清RNA的浓度合适，可进行后续实验。

1.5 qRT-PCR检测 以1.4中提取的组织或细胞总RNA为模板，按TaqMan的miRNAs逆转录试剂盒说明书操作，逆转录生成cDNA，以cDNA为模板，按qSYBR-Green-containing PCR kit (Qiagen，USA)说明书进行操作，检测设备为BioRad IQTM5 Multicolor实时荧光定量系统(USA)。miR-638的引物由Invitrogen公司合成，miR-638引物序列为正义：GAGAGGATCCTGCCGCAGATCGCTG；反义：GAGTAAGCTTCAGGGAGTCCTCTGCC。U6为内参，2-ΔΔCT用于计算相对表达量，ΔΔCT =(CT miRNA-CT U6)target-(CT miRNA-CT U6)control。反应体系为20 μl，每组实验设置3个复孔，分别检测组织样本和细胞系中miR-638的表达情况。

1.6 miRNA/质粒转染 待细胞生长至汇合度达到80%～90%时，用0.25%Trypsin-0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化，1 000 r/min离心10 min后收集胃癌细胞株(AGS)细胞，用含10% FBS的RPMI-1640培养基稀释成密度为5×104/ml的AGS细胞悬液，6孔板中每孔加入2 ml细胞，置于细胞培养箱中。细胞汇合度约80%～90%时准备转染，用无菌EP管配制Lipofectamine 2000和转染试剂(miR-638、scramble、SOX2-mut或SOX2-wt)；两者混匀并室温放置20 min。将混合物加入到无血清培养液(不含抗生素)中混匀，加入到待转染的6孔中；培养箱中培养6 h后换成常规RPMI-1640培养基，可进行后续的划痕实验和侵袭实验。或者在48 h后，收集细胞提取蛋白或RNA，进行后续实验。

1.7 划痕实验 细胞的迁移能力通过wound-healing实验(划痕实验)来验证，所有器械均提前灭菌，直尺和marker笔在实验开始前也要在超净台中紫外台中照射30 min，用marker笔在6孔板背后均匀划横线，每孔至少画5条线，每孔加入约5×105个细胞。第二天用枪头垂直于背后横线划痕，磷酸盐缓冲液(PBS)洗细胞3次，加入无血清培养基，温度为37℃，CO2含量为5%的培养箱中培养，每0、6、12、24 h取样拍照一次，评估miR-638对细胞迁移能力的影响。

1.8 侵袭实验 将实验分成2组：miR-638组和scramble组。铺加适量基质胶稀释液(无血清培养基和基质胶按比例为1∶5稀释)到Transwell小室中，培养箱放置4～6 h后成膜。取100～200 μl细胞密度为(1～5)×105个/ml的AGS细胞悬液加入到Transwell小室上腔，下腔中加入500 μl含血清的完全培养液，培养箱中培养24 h。取空白的24孔板，每孔加入600 μl的4%多聚甲醛溶液，小心用镊子将小室夹出，将小室内残余液体倒掉，轻轻放入加有多聚甲醛的24孔板中，15～20 min后取出小室，轻轻地用棉签擦去膜内侧的细胞并将小室反转晾干。另取一个空白24孔板，给每孔加入600 μl的0.1%结晶紫甲醇溶液，将小室放入，染色30 min，取出小室用PBS洗净。在显微镜(奥林巴斯研究级倒置荧光显微镜OLYMPUS IX73)下观察并拍照。每个小室10个视野，计数取平均值。

1.9 荧光素酶活性检测 将实验分成四组：miR-638与SOX2-wt；scramble与SOX2-wt；miR-638与SOX2-mut；scramble与SOX2-mut，分别共转染上述4组到胃癌细胞株AGS细胞中，48 h后收集细胞。按试剂盒说明书操作，单光子检测仪(Biorad，USA)检测荧光素酶活性。相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值，每组实验设3个复孔，验证SOX2是否为miR-638直接调控的靶基因。

1.10 Western印迹 将实验分四组：miR-638 mimics(miR-638)组、miR-638 inhibitor组与其各自的对照(scramble-1，scramble-2)。分别转染到胃癌细胞AGS中，48 h后提取各组细胞总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度。分别取30 μg样本，进行10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳实验。将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5% BSA室温封闭1～2 h，加入1∶2 000的兔抗人SOX2抗体和1∶1 000兔抗人β-actin抗体(CAT，USA)，4℃过夜。Tris盐酸缓冲液(TBST)洗膜3次，每次10 min，加入1∶800的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔的二抗(博士德，武汉)，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。加入ECL发光剂并用X片曝光、显影、定影、扫描并保存条带图片。Quantity One软件分析，以目的蛋白SOX2条带的灰度值和内参β-actin的蛋白灰度值比值来确定目的蛋白的相对表达水平，每组实验设置3个复孔，检测miR-638对SOX2和EMT相关标志物的蛋白表达的影响。

1.11 统计学方法 应用SPSS19.0软件，两组间数据比较采用T检验，多组间数据比较采用单因素方差分析(one way ANOVA)。

2 结 果

2.1 miR-638在胃癌组织和细胞系中的表达 与癌旁组织进行比较，发现胃癌组织中miR-638的表达显著下调(P<0.05)。随后分别检测miR-638在胃癌细胞株MKN-28，MKN-45，BGC-823，MGC-803，AGS，SGC-7901和HGC-27及人胃黏膜细胞GES-1中的表达，发现胃癌细胞株MKN-28，MKN-45，BGC-823，MGC-803，AGS，SGC-7901和HGC-27中miR-638的表达均下调，且AGS中miR-638的表达最低(P<0.05)，选择AGS进行后续实验。

2.2 过表达miR-638对胃癌细胞AGS的侵袭与迁移能力的影响 划痕实验结果显示，转染miR-638模拟物48 h后，AGS细胞的迁移能力被显著抑制(P<0.05)。见图1。Transwell侵袭实验结果显示，转染miR-638后，AGS的穿膜细胞数量为(35 ± 6)，而对照组即转染scramble组的穿膜细胞数为(130±8)，AGS细胞的迁移能力被显著抑制(P<0.05)。

2.3 miR-638抑制胃癌细胞AGS侵袭与迁移的作用机制 通过TargetScan软件预测，初步推断SOX2是miR-638直接调控的靶基因(图2A)。检测荧光素酶的活性，结果显示：共转染SOX2-wt和miR-638 mimics时，荧光素酶活性强度下降了约43.1%(P<0.05)；而共转染SOX2-mut的miR-638 mimics和scramble之间的荧光素酶活性强度则无显著差异，即SOX2是miR-638直接调控的靶基因。与scramble组比较，miR-638可显著抑制SOX2的mRNA和蛋白表达水平(P<0.05)，EMT相关的上皮标志物E-cadherin的表达显著增加，而EMT相关的间质标志物N-cadherin和Vimentin的表达则显著降低。见图2B。即miR-638可通过靶向SOX2抑制EMT相关通路，从而抑制胃癌细胞的侵袭迁移。

图1 过表达miR-638对胃癌细胞AGS迁移和侵袭能力的影响

A:TargetScan软件预测SOX2是miR-638的靶基因;B:Western印迹检测转染miR-638后SOX2及EMT相关蛋白的表达改变图2 miR-638抑制胃癌细胞AGS迁移与侵袭的内在作用机制

3 讨 论

肿瘤的转移是胃癌病人发生死亡的主要原因之一，发生转移的胃癌病人5年生存率普遍较低〔11〕。目前关于胃癌细胞发生侵袭迁移从而引起胃癌转移的内在作用机制尚不明确，因此也缺乏治疗转移性胃癌的有效治疗手段。侵袭迁移和间质样转化是发生转移时的主要过程〔12〕，因此本研究中主要目标是找到一个与胃癌侵袭迁移和EMT相关的miRNA。

miRNAs是一类与肿瘤的发生发展密切相关的调节基因表达的小分子，miRNAs在人类肿瘤中异常表达是一种较为常见的现象，例如miR-21，miR-106b，miR-17，miR-18a，miR-20a等常在胃癌中表达异常〔13〕。通过转染miR-638到胃癌细胞AGS中，证实miR-638在胃癌中可发挥抑制胃癌细胞的侵袭和迁移的作用。

转录因子SOX2被认为是一种癌基因，可负调控下游相关靶基因的启动子活性〔14〕。研究报道显示异常的SOX2表达与多种肿瘤的发生发展相关，通过刺激表皮生长因子受体(EGFR)和人Bcl2样蛋白(BCL2L1)信号通路，SOX2可引起癌细胞的增殖〔15〕，通过Wnt/β-catenin通路刺激EMT、SOX2可促进肿瘤的侵袭转移〔16〕。通过转染miR-638模拟物到AGS细胞中，检测EMT相关蛋白的变化，本文发现EMT相关的上皮标志物E-cadherin表达增加，间质标志物N-cadherin和Vimentin则表达下调，上皮-间质转化的过程得到逆转，胃癌细胞AGS的侵袭转移被抑制。

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〔2016-09-14修回〕

(编辑 袁左鸣)

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王 钊(1982-)，男，硕士，主治医师，主要从事普外肠胃方面研究。

R73

A

1005-9202(2017)14-3419-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.017

1 邢台医学高等专科学校第二附属医院普外科