花粉破壁率检测方法研究进展

田洪星 殷少文

贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002



花粉破壁率检测方法研究进展

田洪星 殷少文*

贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002

花粉破壁率的高低常被认为是评价花粉破壁方法及破壁粉体质量的重要指标之一，但目前尚没有统一标准的花粉破壁率检测方法。因此，探讨了花粉破壁率不同的检测方法，分析了各种方法的优缺点，并提出了存在的不足之处及发展趋势，以期为花粉破壁率检测方法深入研究奠定基础。

花粉破壁率；检测方法；研究进度

花粉是植物的雄性配子体，存在于雄性花粉囊内，是雄性花蕊上粉状颗粒性细胞与蜜蜂的特殊分泌物所组成的复杂混合物[1]。研究证明，花粉不仅是植物的生命源泉，而且有“微型营养宝库”之称(内含25%～30%蛋白质、20多种易被人体吸收的游离氨基酸，10多种维生素、微量元素、天然活性酶及黄酮类物质)，具有很高的营养价值和医疗保健作用[2-6]。

花粉外壁坚硬主要由是由孢粉素、纤维素、角质和花粉素等致密物质所构成，化学性质很稳定，具有耐酸、耐碱的特性，造成花粉壁内的有效物质浸出受到很大程度的阻碍，使得其有效物质不能被人体充分利用[7]。为了提高花粉的利用价值，人们对花粉外壁做了诸多的探索，其中“花粉破壁技术”就是其中主要的研究方向之一。研究表明[8-9]，通过对花粉进行破壁处理，可以提高花粉的利用率。目前花粉破壁方法主要有复合破壁法[8-9]、物理破壁法[10-11]、生化破壁法[12-13]等，但无论采用哪种破壁方法及工艺条件都应有一个破壁率检测方法，以检验花粉的破壁程度。鉴于目前尚没有统一标准的花粉破壁率检测方法，本文探讨了花粉破壁率不同的检测方法，分析了各种方法的优缺点，并提出了存在的不足之处及发展趋势，拟为花粉破壁率检测方法深入研究奠定基础。

1 显微测定法

1.1 玻片直接计数法与改良组巴氏血球计数法 王华凯等[14]利用破壁前后的花粉能进行定量的对比而求出百分率的方式对比分析了玻片直接计数法与改良组巴氏血球计数器计数法。结果表明，玻片直接计数法简便易行，但因盖玻片有挤压作用，花粉细胞分布不易均匀，按视野计数，具有重叠或遗漏等缺点，且重现性较差。玻片直接计数法的测定方法是利用微量注射器( 或血色素吸管 )分别吸取已配制成等浓度的水溶液破壁花粉浆和未破壁花粉浆稀释液10μL于普通载玻片上，加20mm×20mm盖玻片，置显微镜下，移动推进器，在盖玻片的中心位置，从左到右，从上到下，用高倍镜逐个视野计数。测算所得花粉破壁率(η)公式如下：

破壁率(%)×(对照品中花粉细胞数﹣检品中留存的完整花粉细胞数)/对照品中花粉细胞数×100%；

而改良组巴氏血球计数器计数法则比玻片直接读数法更为合理，因计数室有0.1 mm 深度，花粉细胞不受挤压，四大格分布均匀，重现性好。且在没有微量注射器的情况之下，也可用点眼棒沽取1小滴样品于计数室内，但充填要适度。该操作方法是由一厚玻片制成，整个计数室划分为九大格。每大格面积为1mm2，其深度为0.1mm。 四角之四大格，每格划分为16个中方格，分别吸取已配制成等浓度水溶液的破壁花粉浆和未破壁花粉浆稀释液10μL，沿盖玻片边缘充入计数室，待3～5min，在高倍镜下计数，将四角之四大格细胞总数÷4 即得每大格花粉细胞数。以每mm3，容积细胞数相比较，测算所得花粉破壁率(η)公式如下：

破壁率(%)=100%﹣{100%×(A÷4×10)/(B÷4×10)}

试中：A 检品的四大格总数；

B 对照品的四大格总数。

另外，通过改良组巴氏血球计数器计数法对50余批花粉破壁率测定检查，与玻片直接计数法测定方法相比较，该方法更具有快速、简便、重复性好，结果可靠等优点，可作为今后检测花粉破壁程度的评价指标之一。

1.2 染色法涂片法 该方法主要是在玻片直接计数法的基础上，利用花粉经染色后原生质体呈淡红色、壁为紫红色，形成两者反差大，花粉易于计数的原理进行测定花粉的破壁率。薛妙男[15]通过用定量的碱性品红染色液将破壁和未破壁的中国蜜源花粉分别染色1～1.5h，然后将染色后的花粉液稀释5倍，搅匀后，用移液管取定量花粉液置载片上，涂抹展开于一定面积中，在40℃温箱中烘干，用二甲苯透明2～3min，取出后用加拿大树胶封片，然后进行观察，统计。光镜下，配以目镜测微尺，采用5点取样法计算各点0.5cm2范围内的破壁及未破壁花粉数，按下列公式计算花粉的破壁率：

花粉破壁率(%)=100%×(破壁前完整花粉数﹣破壁后完整花粉数)/破壁前完整花粉数；

由上可知，此法较玻片直接计数法检测法更为合理，颜色上的反差使得花粉易于计数，进一步提供了显微观察结果的可靠性，然而也存在着玻片直接计数法中花粉分布不均匀，重叠或遗漏的现象，因此，该方法值得进一步深入探讨。

1.3 重量分析法配合显微定量法 该法是在上述玻片直接计数法基础之上，参考中药显微定量法，以完整花粉粒为参比物，用重量分析法配合显微定量，测定花粉破壁率[16]。测算所得花粉破壁率(η)公式如下：

花粉破壁率(%)={1-(样品花粉个数/对照花粉个数)×(对照花粉重量/样品花粉个数)}×100%

样品花粉个数为样品花粉二次试样9个视野观察的总平均值；

对照花粉个数为对照花粉二次试样9个视野观察的总平均值；

对照花粉重量为配制混悬液时所称对照花粉的实际重量(mg)；

样品花粉重量为配制混悬液时所称样品的实际重量(mg)。

此法简便易行，采用水合氯醛试液进行装片，并在同1样品2次混悬液观察9个视野花粉粒的平均值，且相对偏差均小于5%。同时增加了重量法分析原理，使得测量结果准确度提高，更加可靠，但是原料必须为单一花粉，不得混有其它花粉及杂质，否则易影响测量结果。

1.4 标准曲线测定法 标准曲线法原理是利用不同浓度的点来探讨自变量和因变量之间的关系的一种定量分析方法。李英等[17]利用此原理摸索了松花粉破壁率与未破壁花粉细胞数的关系，并采用正交试验设计优化了影响测定的各种因素，得出了最佳试验条件。所得的方法曲线线性关系良好、准确度高、简便易行。 实验步骤首先是分别称取未破壁松花粉对照品0g， 1.00g，5.00g， 10.00g、15.00g、 20.00g，用100%破壁松花粉稀释至20.00 g混匀，制成破壁率分别为100%，95%，75%，50%，25%，0%的标样。分别称取各标样0.50g，用水溶解并定容至25.00mL，制成20.00mg/mL的混悬液，然后再分别取经振摇后的混悬液0.25mL于载玻片上，展开成面积约为5cm2的椭圆形薄片，在显微镜(目镜×15、物镜×10)下观察，观察5个视野，记录每个视野内未破壁花粉细胞数，每个标样平行操作3次，求出算术平均值。以破壁率为纵坐标，以每个视野内检出未破壁花粉细胞数的算术平均值为横坐标绘制标准曲线。根据样品中检出未破壁花粉细胞数，按照下公式，计算花粉破壁率：

Y= a+ bX

式中：Y松花粉的破壁率(%)；

X未破壁松花粉算术平均值(个)；

a, b常数。

此法，适用于测定松花粉的破壁率，同时，也适应于多种花粉破壁率的测定，且该法具有精密度、准确度高，简便易行，线性范围广等特点。

2 激光粒度分析法

近年来，随着中药破壁率的研究发展，越来越多的科研学者已不再局限于传统的显微测定法进行破壁率的研究，而是在不断寻求新的破壁率测定方法。其中，激光粒度分析法就是比较具有前瞻性的分析方法，具有很大的发展优势，不仅可以克服显微测定法的主观影响因素大的特性，而且还可以进行中药显微特征不明显的中药材细胞破壁率的测定，另外，具有操作简便易行，结果可靠，准确度高等优点[18]。其原理主要是利用米氏散射理论，散射光的能量分布与颗粒直径的分布直接相关，通过接受和测量散射光的能量分布就可以得出颗粒的粒度分布特征[19-20]。根据所测药材的特性，可选择湿法测定和干法测定。湿法测量是要先将样品与某液体混合配制成悬浮液，并借助于搅拌、超声波等物理条件进行分散处理，使聚集颗粒分散为原始粒子， 并使原始粒子在分散液中保持良好的分散状态；干法测定用于测定水溶性或无合适分散介质的固态试样，通过由空压机提供的高速气流对团聚的颗粒进行冲击分散，然后通过密闭空气池进行测量后被连接的真空吸尘器收集[21]。何煜等[22]首次探讨了中药细胞平均直径、超微粉碎后的粒径、细胞破壁率之间的关系，结果得出了理想的破碎模型计算法，破壁率公式(η)：

η1=[1-(1-1/n)3]×100%(n>1)；

η2=100%(n≤1)；

η=η1+η2；

其中，n为颗粒粒径与细胞直径之比。

在此基础之上，杨瑛等[23]不仅建立了使用重量分析法配合显微定量采用标准曲线法测定蒲黄的细胞破壁率，同时探讨了破壁率与粒径值得关系，结果表明，细胞破壁率与粒径值具有明显的负相关性，随着细胞破壁率的增大，粒径值减小。此外，孙会丽等[24]分别以中药显微定量法及激光粒度分析法测定破壁率为评价指标，对蒲黄超高压撞击流破壁处理进行探讨，优选破壁最佳工艺；比较破壁前后蒲黄在显微、粒度分布等方面的变化，两种方法所测得破壁率结果基本一致。可知，激光粒度法用于代替传统中药显微定量法测定蒲黄破壁率具有一定的可行性，同时，对于其它花粉破壁率激光粒度分析法研究奠定坚实的基础。且该方法简便、快捷，具有客观性的特性。

3 化学成分法

相关文献研究表明，破壁率与化学成分存在一定关系[18,24-26]，在此基础之上，刘英梅等[27]探讨了不同破壁率与不同破壁率花粉中脯氨酸含量的关系，提出了一种测定黑松花粉破壁率的新方法。利用分光光度法测出不同破壁率的样品中脯氨酸含量在 520nm 处的吸光度后，按照下式计算松花粉的破壁率:

Y(%)=(a+bX)×100%

式中:Y：花粉的破壁率(%)；

X：样品脯氨酸含量在 520nm 处的吸光度；

a、b： 为常数。

结果表明，花粉破壁率与其对应的脯氨酸吸光度关系方程为y=11.886x-0.0637，R2= 0.9897。由此可见其线性关系良好，只要测出一种花粉破壁后的脯氨酸吸光度，代入方程，就可以得到其花粉破壁率，简便准确，可避免显微测量破壁率所带来的繁琐操作过程。但存在一定的缺陷，不同的黑松花粉其内在可利用到脯氨酸含量有所不同，测到的破壁率就有所不同，因此，影响结果的可靠性。

4 各种检测方法优缺点总结

纵观目前花粉破壁率检测方法，虽然每一种破壁率检测方法都有自身的优势，但仍存在一些不足之处见表1。

表1 各种检测方法优缺点总结

5 小结与展望

目前学术界普遍认为天然花粉若不经破壳处理，其有效成分便不能充分释放，因此，花粉破壁率的高低便成为评价花粉破壁方法及花粉破壁粉体质量的重要指标之一。就目前文献研究来看，花粉破壁率检测方法主要有显微测定法、激光粒度测定法以及化学成分测定法等方法，但是哪一种检测方法才是比较合理的破壁率检测方法，目前尚没有统一的定论，通过表1各种检测方法优缺点总结，可见，每一种检测方法均有一定的优势和缺陷，因此，何种检测方法才是合理的，有待今后进一步深入研究，但就笔者而言，激光粒度分析法可能是今后探讨花粉破壁率研究一大热点，有望成为一种合理标准的检测方法[24]。

另外，在分析或者研究何种花粉破壁率检测方法更为合理时，首先要明确该检测方法本身是否具有科学性，同时其检验工艺是否存在一定的合理性，能否把产生误差来源的因素降低到最小，使实验结果更为可靠。比如，卢敬慈等[28]对灵芝孢子粉破壁率分析方法的测量不确定度评估及方法改良与优化的思路，就给花粉破壁率分析方法不确定度的分析提供一个很好的例子。因此，在探讨花粉破壁率检测方法时，应针对每种花粉的自身的特异性，对多种检测方法作比较，相互验证，从而制定出合理的破壁率检验标准方法。

基于上述各种论述，笔者提出了以下几方面的建议，以期为今后制定合理的检测标准提供参考：加强破壁率检测方法自身不确定度研究，以降低误差来源因素，提高实验结果的可靠性；加强粒径与花粉破壁率相关性研究以及影响因素的探讨，以实现激光粒度分析法测定花粉破壁率，使检测更为简便，操作易行，克服传统显微的不足之处；加强成分分析测定花粉破壁率研究，破壁率的高低某种程度上与花粉中化学成分成正比关系，但它们的相关性研究还缺乏深入研究；在测量某种花粉破壁率时，应进行多种检测方法的系统研究或是多种方法联合分析，使实验结果更合理与可靠。

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田洪星(1990-)，男，土家族，硕士研究生在读，研究方向为中药、民族药新制剂及新剂型。E-mail:846563439@qq.com

殷少文(1989-)，男，汉族，硕士，研究方向为民族药质量控制及新药研发。E-mail:2488247271@qq.com

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1007-8517(2017)13-0052-04

2017-04-24 编辑：梁志庆)