超临界CO2萃取景天三七总黄酮的工艺优化

张兴桃，张东京，董 增，常志强，汤怀颍

宿州学院生物与食品工程学院，宿州，234000



超临界CO2萃取景天三七总黄酮的工艺优化

张兴桃，张东京，董 增，常志强，汤怀颍

宿州学院生物与食品工程学院，宿州，234000

以景天三七为材料，采用超临界CO2萃取技术提取景天三七总黄酮，设计单因素实验研究萃取温度、压力、夹带剂对总黄酮提取效果的影响，正交试验法研究超临界CO2萃取景天三七总黄酮的最佳工艺条件。结果表明，景天三七的总黄酮类化合物萃取的最佳条件为萃取压力300 Bar、萃取温度45℃、夹带剂为80%乙醇，总黄酮化合物的含量为19.54 mg/g，方差分析表明夹带剂和温度对提取效果影响显著。经重复性验证，该方法准确可靠，重现性好，结果稳定，适用于景天类植物总黄酮的提取。

景天三七；总黄酮；正交设计；超临界CO2萃取

景天三七(SedumaizoonL.)为景天科植物，味甘，微酸，是一种药用价值较高的保健植物，具有止血、消炎、镇痛等作用[1]，有研究表明景天三七的有效主要成分是黄酮、景天庚糖、果糖和有机酸等[2]。总黄酮具有抗肿瘤、抗癌、清热解毒、护肝、延缓衰老等药用功能[3-4]。

超临界CO2萃取技术在中药有效成分的提取上具有操作简单、纯度高等诸多优点[5]。目前超临界CO2萃取景天三七总黄酮的研究较少，本研究旨在用正交设计法优化超临界CO2萃取工艺，确定提取景天三七总黄酮的最佳方案。

1 材料与方法

1.1 材 料

景天三七幼苗在光照培养箱中25℃培养至开花，材料为开花期前期的景天三七全草。

1.2 试剂与主要仪器

1.2.1 试 剂

无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、盐酸、锌粉等(均为分析纯)，芦丁标准品(100 mg,100080-201409，中国食品药品检定研究院)，高纯度CO2。

1.2.2 主要仪器

超临界萃取系统(HA120-50-02，美国Water公司)，紫外分光光度计(U-3100，日本岛津公司)，冷冻干燥机(FD-2A，上海田枫实业公司)，电子天平(FA2004N，上海圣科有限公司)，旋转蒸发器(RE-5299，郑州亚荣仪器有限公司)。

1.3 方 法

1.3.1 景天三七的预处理

取花期的景天三七全草洗净，吸水纸吸水，放到-20℃冰箱中冷冻12 h，冷冻干燥机干燥，取出放入中药材粉碎机，过40目筛，密封，存放阴凉干燥处。每次分装1 g景天三七干粉用滤纸包好装入超临界CO2萃取萃取釜中，拧紧萃取盖，检漏。超临界CO2萃取工艺系统流程如下：

1.3.2 技术流程

粉碎干燥的景天三七→过筛→称3g→超临界CO2萃取→分离纯化总黄酮→鉴定→含量测定→确定最佳工艺。

1.3.3 芦丁标准曲线的制作

将芦丁标准品放入真空干燥箱中，120℃减压干燥至恒重，精密称取芦丁标准品20 mg，用60%乙醇溶解，摇匀，定容至100 mL，配成0.2 mg·mL-1的芦丁标准品溶液，作为标准品贮备液待用，避光放置。量取标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于6支10 mL比色管中。在501 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、芦丁浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.3.4 最佳测定波长的确定

精密量取配制的景天三七总黄酮溶液1.0 mL和芦丁标准液1.0 mL，分别放置于10 mL比色管中，用50%乙醇稀释至刻度5.0 mL，加入0.4 mL体积分数为5% NaNO2溶液，摇匀，静止5 min，加入0.4 mL 5% Al(NO3)3溶液，摇匀，静置5 min，再加4 mL 4%NaOH，用50%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，放置10 min。紫外分光光度计在300～600 nm之间进行波长扫描[6]，在501 nm处找到最大吸收峰，确定该波长为最佳测定波长。

1.3.5 总黄酮含量的计算

分别在10 mL比色管中加入稀释10倍后的景天三七提取液0.0 mL与1.0 mL。在501 nm波长下测得吸光度A。将A代入芦丁标准曲线的回归线性方程中得出浓度，然后按照下列方程计算总黄酮的含量。根据数据得出用超临界CO2萃取黄酮类物质的最佳条件。

式中，P表示总黄酮含量(mg/g)，C表示总黄酮浓度(mg/mL)，N表示萃取液的稀释倍数，V表示萃取液的体积(mL)，W表示景天三七原料投料量(g)。

1.3.6 单因素实验

以萃取压力、萃取温度、夹带剂浓度为3个单因素，每个因素分别设计5个水平，3次重复，其中一个因素改变，其他因素不变。设定萃取时的压力分别为150、200、250、300、350 Bar，设温度分别为35、40、45、50、55℃，夹带剂分别为体积分数为50%、60%、70%、80%、90%乙醇5个水平。

1.3.7 正交设计实验

以15 mL/min为流速，设置夹带剂浓度(80%乙醇、70%乙醇、60%乙醇)、萃取压力(200、250、300 Bar)和温度(40、45、50 ℃)为3个因素，设立3个水平。用正交软件进行方案设计，平行3次(表1)。

表1 正交因素水平表

1.3.8 景天三七萃取液的纯化结晶

采用超临界CO2萃取法得到景天三七总黄酮萃取液，然后将萃取液放入旋转蒸发器中，去除萃取液中的乙醇，得到总黄酮水溶液，最后将该溶液放入冷冻干燥机干燥至粉末，即得到总黄酮粉末。

1.3.9 黄酮类物质的鉴定

将冷冻干燥所得的总黄酮粉末置于50 mL小烧杯中，加入25 mL体积分数为50%的乙醇充分溶解，取适量的溶液置于10 mL试管中，滴加四五滴浓盐酸，摇匀后再加入适量锌粉，发生剧烈反应。根据HCl-锌粉的颜色反应，观察反应的颜色变化。黄酮类物质具有邻酚羟基，可与锌离子形成黄色或橙红色络合物，使用HCl-锌粉反应可以鉴别是否有总黄酮物质。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

根据1.3.6的方法绘制标准曲线，回归曲线方程为y=0.0114x+0.015,其R2=0.9989(图1)。

图1 芦丁吸光度标准曲线

2.2 单因素实验分析

2.2.1 温度对总黄酮萃取量的影响

温度为30℃～50℃时，总黄酮含量与温度呈正相关，温度为50℃时总黄酮含量最高为17.59 mg·g-1，表明总黄酮的量随萃取温度的升高而增加，但温度超过50℃时，总黄酮量呈下降趋势(图2)。

图2 温度对景天三七总黄酮萃取量的影响

2.2.2 夹带剂浓度对总黄酮萃取量的影响

乙醇浓度在50%～80%时，总黄酮含量不断上升。当乙醇浓度为80%时，总黄酮含量达到最高，为18.32 mg/g；当乙醇浓度超出80%时，总黄酮含量呈下降趋势(图3)。

2.2.3 萃取压力对总黄酮萃取量的影响

萃取压力200～300 Bar时，总黄酮含量上升较为明显；当萃取压力为300 Bar，总黄酮含量达到最高，为19.22 mg·g-1；萃取压力超过300 Bar时，总黄酮含量呈下降趋势(图4)。出现此类情况可能是：其他条件不变时，分子间平均自由程与压力呈负相关。但溶质与溶剂间亲和性增强，流体CO2的扩散与渗透能力增大，提高了超临界 CO2的溶解能力。

图3 夹带剂浓度对景天三七总黄酮萃取量的影响

图4 压力对景天三七总黄酮萃取量的影响

2.3 总黄酮鉴定

采用HCl-锌粉颜色反应鉴定景天三七总黄酮，所得结果如图5所示。

图5 正交试验提取物黄酮鉴定图

2.4 正交实验分析

根据统计学原理，极差越大，显著性越明显。A(乙醇浓度)极差最大，为5.804，可以判断夹带剂乙醇浓度对景天三七总黄酮萃取量的影响最大；B(萃取压力)和C(温度)极差值分别为1.860和0.927，对总黄酮萃取量的影响较小。最佳提取工艺条件80%的乙醇作为夹带剂、萃取压力300Bar、温度45℃条件下，总黄酮萃取量为19.54 mg/g(表2)。

表2 景天三七中提取总黄酮的正交设计直观分析

方差分析表明，该模型P温度=0.004<0.01，差异极显著；P夹带剂=0.002<0.01，P压力=0.015<0.05，表明萃取、夹带剂、温度对垂盆草总黄酮的提取影响极显著，压力的影响显著(表3)。

表3 景天三七中提取总黄酮的方差分析表

注：*表示P<0.05显著， **表示P<0.01极显著。

3 结 论

采用超临界CO2萃取法提取景天三七中黄酮类，并运用相应的软件对正交实验结果进行极差和方差分析，结果表明：对景天三七中总黄酮萃取量的影响程度从高到低依次为夹带剂浓度>萃取压力>萃取温度。以1.0 g样品计，景天三七总黄酮的最优提取工艺条件为萃取压力300 Bar、萃取温度为45℃，以80%乙醇为夹带剂，所提取出的总黄酮含量为19.54 mg/g。超临界CO2萃取法在提取景天三七总黄酮具有耗时短、无残留溶剂和重金属残留、纯度高等优点。

[1]谢宗万.中药材品种论述：上册[M].2版.上海:上海科学技术出版社,1989:79-80

[2]张晶晶，王晶，薛娇，等．费菜茎叶的化学成分[J]．沈阳药科大学学报．2010，27(8):635-638

[3]李秋红，罗莉萍，叶文峰.超临界CO2萃取杜仲叶总黄酮的研究[J].食品科学，2006(12)：536-538

[4]万茵,谢明勇,董欢欢,等.超临界CO2流体提取车前子总黄酮的工艺优化[J]．南昌大学学报：理科版,200731(2):160-163

[5]公衍玲,黄山,于慧荣.垂盆草总黄酮的酶法提取及其抑菌活性[J].药学实践杂志,2010,28(2):114-115

[6]张珊珊,朱文娴,赵晓红,等.超临界CO2萃取北方地区早园竹叶中总黄酮的工艺优化[J].食品科学,2011,32(6):143-147

(责任编辑：汪材印)

10.3969/j.issn.1673-2006.2017.05.034

2016-12-10

国家自然科学基金项目(21107078),宿州学院区域发展协同创新中心课题(2015SZXTZXKFZD02、2015SZXTZXKF06)。

张兴桃(1978-)，安徽宿松人，硕士，副教授，主要研究方向：植物分子生物学。

TS201.1

：A

：1673-2006(2017)05-0119-04