酶-超声法提取蓝莓花青素

吴 丹 阳， 钱 方， 牟 光 庆

( 大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连 116034 )

酶-超声法提取蓝莓花青素

吴 丹 阳， 钱 方， 牟 光 庆

( 大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连 116034 )

用酶-超声波辅助法提取蓝莓花青素，得到最优提取条件为蓝莓粉与水按质量比1∶40混合，体系pH 1.0，超声功率200 W，纤维素酶用量3.0 mg/g，温度45 ℃，反应时间20 min。比较了AB-8、H103、D001×7和D201×1 4种大孔树脂和乙醇、丙酮和乙酸乙酯3种洗脱液对蓝莓花青素的吸附与解吸效果。结果表明，AB-8型大孔树脂的分离效果最好，在pH 3.0、30 ℃条件下吸附180 min，70%乙醇解吸90 min，蓝莓花青素色价由12.7提高到67.8，提高了5.3倍。

蓝莓；花青素；酶-超声法

0 引 言

蓝莓花青素属类黄酮类物质，主要集中在果皮中，质量分数1.00～6.98 mg/g，因蓝莓品种不同而存在差异[1]。具有抗炎症、提高免疫力、抗心血管疾病、抗衰老、抗癌等生理功效[2]。

目前，花青素的提取方法主要包括溶剂萃取法、超临界流体萃取法、微波法、超声波辅助提取法和酶法[3]。其中，溶剂萃取法最常用，简单易行，但能耗较大；超临界流体萃取法主要适于脂溶性色素提取，蓝莓花青素为水溶性，此法并不适用[4]；微波法选择性强，能耗小，但加热温度高，易破坏花青素结构[5]。超声波辅助提取法通过超声波空化等效应加速花青素的溶出，提取周期短，效率高[6]；酶法提取可较温和的将细胞壁分解，提高提取率[7]。张学宁等[8]比较了水浴法、超声波法和微波法提取蓝莓花色苷，并确定最佳工艺条件。本研究拟将对花青素影响较小的酶法和超声波辅助提取法相结合提取蓝莓花青素，并用树脂进一步分离，确定其最优条件，以提高花青素产率。

1 材料与方法

1.1 材 料

蓝莓，购自庄河市大营镇大连蓝莓基地，-18 ℃ 冷冻保存。

纤维素酶，1 800 U/mg，上海源叶生物科技有限公司；大孔树脂AB-8、H103、D001×7、D201×1，上海华羚树脂有限公司。

1.2 蓝莓花青素的制备工艺

原料预处理→蓝莓粉→酶-超声法辅助提取→离心除杂→树脂分离→干燥→蓝莓花青素[6,8]。

1.2.1 原料预处理

蓝莓冻果在室温下解冻，清洗后在匀浆机中匀浆，倒盘后放入鼓风干燥箱中，55 ℃干燥15 h。将干燥后的蓝莓用中药粉碎机进行粉碎，过80目筛，制成蓝莓干粉，避光保存[5]。

1.2.2 酶-超声波辅助法提取蓝莓花青素

蓝莓粉以水提取，加入1%纤维素酶液，分别在不同料液比、酶用量、pH、超声功率、温度、时间条件下进行提取。4 000 r/min离心10 min，上清液即为蓝莓花青素粗提液。测定A530优化蓝莓花青素提取的工艺条件[9-10]。

1.2.3 蓝莓花青素的分离

采用树脂静态吸附法分离蓝莓花青素[11-12]。将蓝莓花青素粗提液适当稀释测定A0。取25 mL 花青素稀释液加入装有1.0 g树脂的三角瓶中，150 r/min振荡一段时间后抽滤，测定滤液吸光度，收集滤后树脂于三角瓶中，加入25 mL洗脱液，150 r/min振荡解吸后抽滤，测定滤液吸光度，滤液即为纯化后的蓝莓花青素[13-14]。吸附率和解吸率按下式计算[15]：

吸附率=(A0-A1)/A0×100%

解吸率=A2/(A0-A1)×100%

式中：A0为粗提液的吸光度，A1为吸附后溶液的吸光度，A2为解吸后溶液的吸光度。

1.2.4 蓝莓花青素的测定

分别将蓝莓花青素粗提液和纯化后的蓝莓花青素冷冻干燥制成花青素粉。取花青素粉0.100 g，用pH 3.0 HCl定容至100 mL，适当稀释后，用1 cm比色皿在530 nm处测定其吸光度，计算花青素含量。记粗提花青素的色价为E0，纯化后花青素色价为E1。

2 结果与分析

2.1 蓝莓花青素提取条件的优化

2.1.1 酶用量对蓝莓花青素提取的影响

由图1可知，纤维素酶用量在0～3.0 mg/g时，花青素提取量随着酶量的增加而增大，3.0 mg/g 时达到最大，为0.420。增大酶用量，提取量不会增加，反而略有降低。因此，纤维素酶最佳用量为3.0 mg/g。

图1 酶用量对蓝莓花青素提取的影响(P<0.05)

2.1.2 pH对蓝莓花青素提取的影响

pH对花青素的色调影响较大。水溶液中，花青素以黄洋盐阳离子(AH+)、醌式碱(A)、甲醇假碱和查尔酮4种形式存在。这4种结构可以相互转换，pH<2时，花青素以AH+(红色)形式存在，随着碱性增强，AH+转变成A(蓝色)。pH逐渐升高至4～5，两种有色物质浓度降低，无色甲醇假碱浓度升高而缓慢生成无色查尔酮，导致吸光度下降[10]。由图2可知，花青素提取量在pH 1.0时最大，A530达到了1.151，因此，最佳提取pH为1.0。

图2 pH对蓝莓花青素提取的影响(P<0.05)

2.1.3 料液比对蓝莓花青素提取的影响

由图3可知，料液比在1∶30～1∶40，花青素的提取量随料液比增大而增加，1∶40时最大，A530为1.638。料液比再增加，提取量反而减少。因此，最佳料液比应为1∶40。

图3 料液比对蓝莓花青素提取的影响(P<0.05)

2.1.4 超声功率对蓝莓花青素提取的影响

由图4可知，功率为0～120 W时，花青素提取量差异并不显著。随着功率增大，花青素提取量逐渐增加，200 W时最大。增大功率，花青素提取量明显增大。考虑到过高的超声功率会破坏花青素结构，将最佳提取功率设定为200 W。

图4 超声功率对蓝莓花青素提取的影响(P<0.05)

2.1.5 温度对蓝莓花青素提取的影响

由图5可知，温度对花青素提取量的影响差异较显著，随温度的升高呈先增大后减小的趋势，45 ℃时达到最大值，A530为1.492，表明纤维素酶活性随着温度升高而逐渐增大，并在45 ℃时花青素的提取量最大。升温会使平衡向生成无色查尔酮方向移动，而有色物质的含量降低[11]。因此，最佳提取温度应选为45 ℃。与文献[8]中从蓝莓果中提取花青素的温度基本一致。

图5 温度对蓝莓花青素提取的影响(P<0.05)

2.1.6 提取时间对蓝莓花青素提取的影响

由图6可以看出，提取量随时间变化并不显著。延长时间提取量略有降低，可能是过长时间会导致花青素氧化分解[10]，而且时间长也会增加能源消耗。因此，最佳提取时间为20 min。

图6 提取时间对蓝莓花青素提取的影响(P<0.05)

2.2 蓝莓花青素分离纯化条件的优化

2.2.1 树脂的选择

通过吸附4 h、解吸2 h来观察不同树脂的吸附与解吸效果。由图7可知，不同类型树脂对蓝莓花青素分离效果影响显著。AB-8的吸附与解吸效果最好。这是因为蓝莓花青素属弱极性化合物，吸附蓝莓花青素的最佳树脂应为弱极性或非极性。从解吸效果来看，虽然D201和D001对蓝莓花青素有一定的吸附作用，但解吸效果并不好，可能是D201和D001的极性很大，与色素物质共价键结合能力太强，导致色素无法洗脱下来。因此选择AB-8为吸附树脂。

2.2.2 pH对AB-8树脂吸附效果的影响

由图8可知，随着pH的增大，AB-8树脂对色素的吸附率逐渐下降。但pH在1.0～3.0时吸附率的差异不显著，考虑到实验操作性，选择pH为3.0。

图7 树脂类型对蓝莓花青素吸附率和解吸率的影响(P<0.05)

Fig.7 Effect of resin type on blueberry anthocyanins in adsorption and desorption (P<0.05)

图8 pH对AB-8树脂吸附效果的影响(P<0.05)

2.2.3 温度对AB-8树脂吸附效果的影响

由图9可知，温度对AB-8树脂吸附效果影响不显著。温度过高有利于平衡向生成无色查尔酮方向移动，色素分解[10]。考虑到实验操作性，树脂吸附温度30 ℃较为合适。

图9 温度对AB-8树脂吸附效果的影响(P<0.05)

2.2.4 吸附时间对AB-8树脂吸附效果的影响

由图10可知，吸附时间在180 min后，吸附率的变化差异不显著。随着吸附时间的延长，树脂吸附逐渐达到饱和，但再延长时间，吸附效果不会增强，甚至会出现解吸附现象。为使树脂饱和吸附且防止时间过长出现解吸附现象，选择吸附时间为180 min。

图10 吸附时间对AB-8树脂吸附效果的影响(P<0.05)

Fig.10 Effect of adsorption time on resin AB-8 adsorption (P<0.05)

2.2.5 乙醇体积分数对树脂解吸效果的影响

由图11可知，乙醇体积分数对花青素洗脱效果影响显著。考虑到乙醇体积分数过大可能造成蓝莓花青素结构的破坏，确定乙醇体积分数为70%。

图11 乙醇体积分数对AB-8树脂解吸效果的影响(P<0.05)

Fig.11 Effect of ethanol concentration on resin AB-8 desorption (P<0.05)

2.2.6 解吸时间对树脂解吸效果的影响

由图12可知，随着时间的延长，树脂的解吸程度逐渐增大，在90 min时，解吸率最大，随后逐渐降低。可能是解吸时间过长，色素出现了重新吸附现象。因此，解吸时间选为90 min。

3 结 论

用酶-超声波辅助提取蓝莓花青素，确定最佳工艺条件为：蓝莓粉与水按质量比1∶40混合，体系pH 1.0，超声功率200 W，纤维素酶用量3.0 mg/g，温度45 ℃，提取时间20 min。

图12 解吸时间对AB-8树脂解吸效果的影响(P<0.05)

Fig.12 Effect of desorption time on resin AB-8 desorption (P<0.05)

蓝莓花青素粗提物选用AB-8型树脂在pH 3.0、30 ℃条件下吸附180 min，再用70%乙醇解吸90 min。粗提花青素色价E0为12.7，纯化后花青素色价E1为67.8，与文献[11]中报道的色价相一致，提取倍数为5.3。

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Extraction of blueberry anthocyanins by enzyme-ultrasonic method

WU Danyang, QIAN Fang, MU Guangqing

( School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

Enzyme-ultrasonic assisted extraction method was used to extract blueberry anthocyanins. The optimum extraction conditions were as follow: the mass ratio of blueberry powder and water of 1∶40, system pH 1.0, ultrasonic power 200 W, cellulase enzyme dosage 3.0 mg/g, temperature 45 ℃, reaction time 20 min. The effect of four macroporous resins of AB-8、H103、D001×7、D201×1 on blueberry anthocyanins adsorption and three eluents of ethanol, acetone, acetic ester on the blueberry anthocyanins desorption were compared respectively. The results showed that the best macroporous resin for purifying blueberry anthocyanins was AB-8, and its optimal separation condition was pH 3.0 adsorbed at 30 ℃ for 180 min and then 70% ethanol desorbed for 90 min. The color value of blueberry anthocyanin increased from 12.7 to 67.8, and the extraction times increased of 5.3.

blueberry; anthocyanin; enzyme-ultrasonic method

2015-12-24.

辽宁省自然科学基金项目(2014026018).

吴丹阳(1990-)，女，硕士研究生;通信作者：钱 方(1966-)，女，教授.

TS202.3

A

1674-1404(2017)04-0260-05

吴丹阳,钱方,牟光庆.酶-超声法提取蓝莓花青素[J].大连工业大学学报,2017,36(4):260-264.

WU Danyang, QIAN Fang, MU Guangqing. Extraction of blueberry anthocyanins by enzyme-ultrasonic method[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(4): 260-264.