栉孔扇贝裙边酶解物及其美拉德产物特性

孙 世 广， 李 傲 婷， 唐 越， 孙 娜， 于 翠 平， 吴 海 涛

( 1.大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连 116034；2.大连工业大学 国家海洋食品工程技术研究中心, 辽宁 大连 116034 )

栉孔扇贝裙边酶解物及其美拉德产物特性

孙 世 广， 李 傲 婷， 唐 越， 孙 娜， 于 翠 平， 吴 海 涛

( 1.大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连 116034；2.大连工业大学 国家海洋食品工程技术研究中心, 辽宁 大连 116034 )

以中性蛋白酶和木瓜蛋白酶为工具酶，制备栉孔扇贝裙边酶解物。研究了酶解物的水解度(DH)、肽分子质量分布、氨基酸组成、酶解物及美拉德产物清除DPPH自由基的能力。结果表明，加酶量3 000 U/g，底物质量分数4%，酶解时间3 h，经中性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解获得的酶解物水解度分别达到了37.6%和19.2%。酶解物中的肽分子质量以3 ku以下为主，其中木瓜蛋白酶水解产物占59.7%～67.6%，中性蛋白酶水解产物占64.5%～78.2%。随着酶解时间的延长，酶解物对DPPH的清除能力逐渐提高。经美拉德反应后，IC50降低到酶解物的1/17～1/36，抗氧化能力显著提高。

栉孔扇贝；裙边；酶解物；抗氧化；美拉德反应

0 引 言

扇贝作为我国重要的海洋经济贝类，具有很高的营养价值[1]。据统计，2014年全国扇贝养殖产量近165万t[2]。栉孔扇贝(Chlamysfarreri)是我国北方最重要的海水经济养殖贝类之一，随着扇贝养殖规模的扩大，扇贝加工量也随之增加。扇贝柱产品在生产和加工过程中，产生大量低值副产物，如扇贝裙边，约占活体扇贝质量的9%[3]，富含蛋白质，是开发活性肽的良好来源。

天然蛋白水解物由于具有抗氧化活性一直受到广泛关注[4]。以蛋白水解物或多肽为原料，通过与还原糖热反应，研究其美拉德反应特性，并发现抗氧化活性得到较大提高[5]。目前，有关栉孔扇贝裙边的研究主要集中于脂肪酸组成分析[6]、多糖的生物活性研究[7]、酶解肽的生物活性[8]、利用裙边开发调味品[9]等，有关栉孔扇贝裙边酶解物美拉德反应产物的研究尚未见相关报道。

本研究以栉孔扇贝裙边为原料，以中性蛋白酶和木瓜蛋白酶为工具酶，制备栉孔扇贝裙边酶解物，在明确酶解物的肽分子质量分布、氨基酸组成的基础上，研究栉孔扇贝裙边酶解物与核糖发生美拉德反应后，其产物对DPPH自由基的清除能力，为栉孔扇贝裙边的高效利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 原 料

新鲜栉孔扇贝，2015年3月购自大连长兴市场，清洗后取裙边，沸水浴10 min热变性处理，冷冻干燥、粉碎后获得栉孔扇贝裙边冻干粉，于-18 ℃冷冻保存。

1.1.2 主要试剂与设备

木瓜蛋白酶、Cytochrome C (12.5 ku)、Aprotinin (6.5 ku)、二甘氨酰甘氨酸(0.19 ku)、丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、N,N-四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸钠、过硫酸铵、甘氨酸、巯基乙醇等，上海生工生物工程有限公司；蛋白质分子质量标准品，宝生物工程(大连)有限公司；中性蛋白酶，南宁庞博生物工程有限公司；Vitamin B12 (1.3 ku)、还原型谷胱甘肽(0.3 ku)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，美国Sigma-Aldrich公司；氨基酸衍生化溶液，依利特公司；其他试剂均为生化试剂或分析纯。

AE-6450垂直电泳仪槽，日本ATTO；MF-ChemiBIS 2.0凝胶成像仪，DNR Bio-imaging；P230半制备高效液相色谱、P1201高效液相色谱，大连依利特分析仪器有限公司；SuperdexTM Peptide 10/300 GL凝胶过滤色谱柱，GE Healthcare公司；Infinite200 NANO酶标定量测定仪，TECAN；SZF-106A粗脂肪测定仪，上海新嘉电子有限公司；KDN-103F自动定氮仪，上海纤检仪器有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 SDS-PAGE电泳检测

取一定量新鲜栉孔扇贝裙边，加入等体积5×上样缓冲液(250 mmol/mL，pH 7.5的Tris-HCl缓冲液，8 mol/mL尿素，5% SDS，5%巯基乙醇)，100 ℃煮沸5 min，振荡过夜，16 500g离心后取上清，进行SDS-PAGE电泳检测。

1.2.2 化学组成分析

蛋白含量测定采用凯式定氮法，脂肪含量测定采用GB 5009.6—2003索式抽提法，总糖含量测定采用苯酚硫酸法，灰分测定采用GB 5009.4—2010方法，水分测定采用GB 5009.3—2010直接干燥法。

1.2.3 酶解工艺

分别采用中性蛋白酶(204.3 kU/g)和木瓜蛋白酶(214.8 U/g)对栉孔扇贝裙边冻干粉进行酶解，酶解条件：加酶量3 000 U/g，底物质量分数4%，恒定pH 7.0，酶解温度50 ℃，酶解时间分别为0.5、1、2、3 h，酶解后沸水浴灭酶10 min，4 000 r/min 离心10 min，取上清液冷冻干燥，粉碎后密封，-18 ℃冷冻保存。

1.2.4 水解度的测定

采用pH-stat法，以滴定所消耗的标准NaOH溶液体积，计算水解度。

DH=Vc/mαbt×100%

式中：DH为水解度，%；V为NaOH体积，mL；c为NaOH浓度，mol/L；m为底物中蛋白总量，g；bt为底物蛋白质中肽键总数，mmol/g，本研究中以7.5计；α为水解过程中α-氨基的解离度。

1.2.5 分子质量分布

将样品溶于超纯水中，质量浓度为2 mg/mL，过0.45 μm微孔膜后，分子质量分布范围采用P230半制备高效液相色谱匹配SuperdexTM Peptide 10/300 GL凝胶过滤色谱柱测定。进样量25 μL，检测波长220 nm；流动相超纯水、乙腈、三氟乙酸的体积比为70∶30∶0.1，洗脱体积流量0.4 mL/min。分子质量标准品分别选用Cytochrome C(1.25 ku)，Aprotinin(6.5 ku)，Vitamin B12(1.35 ku)，还原型谷胱甘肽(0.3 ku)，二甘氨酰甘氨酸(0.19 ku)。对凝胶过滤色谱而言，分子质量的对数(y)与保留时间(x)呈线性关系，经过计算所得分子质量标准曲线为y=-0.077 2x+5.782 3(R2=0.990 1)。

1.2.6 总氨基酸测定

采用Elite-AAK氨基酸分析系统测定样品的总氨基酸含量。取25 mg样品于安培瓶中，加入3 mL 6 mol/L HCl或4 mol/L NaOH，作为两种水解方式。封口后于110 ℃水解24 h。将水解后样品移入蒸发皿，并在80 ℃水浴锅中蒸干。用衍生缓冲液多次洗涤蒸发皿，洗液转入25 mL容量瓶中，并用衍生缓冲液定容。0.45 μm膜过滤后，取5 mL溶液，加入25 mL棕色容量瓶中，再加入2.5 mL衍生化溶液。混匀后60 ℃水浴中暗反应60 min，冷却至室温，用平衡缓冲液稀释至刻度，静置15 min，0.45 μm膜过滤后加入自动进样瓶后放入As 1201自动进样器。

总氨基酸采用P1201高效液相色谱(依利特)匹配UV1201紫外检测器测定，检测波长为360 nm。流动相A为体积比1∶1的乙腈-水溶液，流动相B为含有1% N,N-二甲基甲酰胺和0.41%流动相B固体成分的去离子水(用冰醋酸调pH至6.4～6.8)。进样量10 μL，体积流量1.2 mL/min，柱温27 ℃。

1.2.7 美拉德反应

用去离子水配制栉孔扇贝裙边酶解物20 mg/mL 和核糖溶液40 mg/mL，将两种溶液等体积混合，用0.1 mol/mL的NaOH将混合液pH调至7.0或8.0，分装于4 mL旋盖玻璃瓶中，置于干浴器中反应，反应温度为95 ℃，反应时间为12 h，反应结束后，将美拉德反应原液经冷冻干燥后粉碎，-18 ℃冷冻保存。

1.2.8 DPPH自由基的清除

测定方法参考文献[10]进行，稍有调整：取1 mL 不同浓度多肽样品溶液与2 mL pH 6.0 0.1 mol/mL 的磷酸盐缓冲液，以及2 mL 200 μmol/L 的DPPH乙醇溶液混合均匀，漩涡振荡后，室温下避光静置30 min。在2 000g转速下离心15 min后，取上清液在517 nm测定其吸光度。DPPH自由基清除率计算公式：

X=(A0-A1)/(A0-A2)

式中：A1为样品吸光度；A2为以95%乙醇代替DPPH溶液时测定的吸光度；A0为以去离子水代替样品的吸光度。

1.2.9 DPPH自由基半抑制率(IC50)的计算

以扇贝裙边酶解物或其美拉德反应产物质量浓度(mg/mL)为横坐标，DPPH清除率(%)为纵坐标，采用Excel软件作散点图，并作线性回归方程分析，获得相关系数R2，R2大于0.85即代表可信，通过回归方程，计算出DPPH自由基清除率为50%时，所对应的扇贝裙边酶解物或其美拉德反应产物的浓度，即为DPPH自由基IC50。

2 结果和讨论

2.1 新鲜栉孔扇贝裙边蛋白质组成分析

采用“1.3.1”的方法提取栉孔扇贝裙边的总蛋白，并进行SDS-PAGE电泳检测。由图1可见，新鲜栉孔扇贝裙边主要的蛋白质条带主要有5条，其中在200 ku附近出现的条带为肌球蛋白重链；在97 ku附近出现条带为副肌球蛋白，它是无脊椎动物特有的肌原纤维蛋白质，与双壳贝类闭壳肌的特殊运动有关；在40 ku左右的条带为肌动蛋白[9]。

HM，高分子质量标准marker；LM，低分子质量标准marker；2、4、8、16、32，栉孔扇贝裙边蛋白质提取物分别稀释2、4、8、16及32倍的样品

图1 新鲜栉孔扇贝裙边蛋白质组成分析

Fig.1 Compositions of proteins from fresh scallopChlamysfarreriskirt

2.2 冻干粉的主要化学组成分析

采用“1.3.2”的方法对栉孔扇贝裙边冻干粉的主要化学组成进行测定，其粗蛋白、粗脂肪、总糖、灰分及水分含量见表1。由表1可知，栉孔扇贝裙边冻干粉中富含蛋白质，粗蛋白含量最高。同时，栉孔扇贝裙边冻干粉中也含有一定量的糖、脂肪和灰分。结果表明，栉孔扇贝裙边是一种高蛋白含量的水产资源，是开发酶解物及活性肽的良好来源。

表1 栉孔扇贝裙边冻干粉主要化学组成

2.3 冻干粉的水解

采用“1.3.3”和“1.3.4”的方法酶解栉孔扇贝裙边冻干粉，并测定水解过程中水解度的变化情况，结果如图1所示。由图1可见，随着酶解时间的延长，栉孔扇贝裙边的水解度不断升高。在相同的酶解时间下，中性蛋白酶的DH高于木瓜蛋白酶。在酶解前30 min，两种酶解条件的DH都快速上升；在30～120 min缓慢升高，120 min后趋于稳定。当酶解180 min时，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的DH分别达到了37.6%和19.2%。结果表明，利用中性蛋白酶酶解栉孔扇贝裙边干粉可获得较高的酶解效率。

图2 栉孔扇贝裙边冻干粉酶解过程中的水解度曲线

Fig.2 DH curves of freeze-dried scallopChlamysfarreriskirt powder in hydrolysis process

2.4 酶解物的分子质量分布

采用“1.3.5”方法对8种酶解物的肽分子质量分布进行分析，结果见图3。由图3可知，经木瓜蛋白酶和中性蛋白酶酶解获得的栉孔扇贝裙边酶解物，其主要组分分子质量均分布在1～3 ku。对于木瓜蛋白酶的酶解产物，随着酶解时间的延长，分子质量大于5 ku的肽分子组分比例逐渐减少，而分子质量小于3 ku的肽分子组分逐渐增多。对于中性蛋白酶的酶解产物，随着酶解时间的延长，分子质量大于1 ku的肽分子组分比例逐渐减少，而分子质量小于1 ku的肽分子组分逐渐增多。很多研究显示，分子质量在3 ku以下的肽段活性较强，且肽链中疏水性氨基酸、芳香族氨基酸的含量较高时，其抗氧化活性也较为显著[11]。酶解时间在0.5～3 h范围内，随着酶解时间的延长，酶解物中分子质量0.2～3 ku的肽组分比例逐渐增多，质量分数总和分别达到59.7%～67.6%(木瓜蛋白酶)和64.5%～78.2%(中性蛋白酶)。结果表明，经中性蛋白酶酶解获得的栉孔扇贝裙边酶解物3 ku以下的肽组分比例较大，这与中性蛋白酶对栉孔扇贝裙边酶解的水解度较高相一致。

图3 栉孔扇贝裙边酶解物的分子质量分布

2.5 酶解物的氨基酸组成

以中性蛋白酶为工具酶，对栉孔扇贝裙边冻干粉酶解2 h，获得酶解物。采用“1.3.6”方法测定其氨基酸组成，结果见表2。栉孔扇贝裙边酶解物中富含Asp、Glu、Gly、Leu、His及Lys，质量分数均超过5%。酶解物中Ala、Val、Lys、Pro、Leu、His、Tyr及Met等氨基酸的抗氧化活性较强[12]，酶解物中这些抗氧化氨基酸的总质量分数达到384.7 mg/g，说明栉孔扇贝裙边酶解物具有一定的抗氧化能力。

表2 栉孔扇贝裙边酶解物的氨基酸组成

2.6 酶解物及其美拉德反应产物的抗氧化能力

采用“1.3.7”的方法对栉孔扇贝裙边酶解物进行美拉德反应，进一步采用“1.3.8”的方法评价酶解物及其美拉德产物的抗氧化能力，结果如表3所示。在一定浓度范围内，酶解物及其美拉德产物均具有一定的DPPH自由基清除能力，且清除能力与浓度成线性正比关系，根据线性回归方程计算IC50。从表3中可以看出，相同的酶解时间，中性蛋白酶酶解物清除DPPH的IC50比木瓜蛋白酶酶解物略低，抗氧化能力略强。同种酶的酶解物，随着酶解时间的延长，对DPPH的清除能力逐渐提高。酶解物经美拉德反应后，IC50降低到酶解物的1/17～1/36，抗氧化能力显著提高。对于栉孔扇贝裙边酶解物而言，美拉德反应过程中pH 7或8的条件对其抗氧化能力影响不大，总体而言pH 8条件下IC50略低。结果说明，美拉德反应是提高栉孔扇贝裙边酶解物的抗氧化能力的有效途径。

表3 栉孔扇贝裙边酶解物及其美拉德产物对DPPH自由基的清除能力[以IC50衡量]

3 结 论

栉孔扇贝裙边冻干粉中主要化学成分为蛋白质，粗蛋白达到裙边干基的(68.71±0.41)%，以中性蛋白酶及木瓜蛋白酶为工具酶酶解栉孔扇贝裙边冻干粉，中性蛋白酶水解效率较高。酶解物清除DPPH自由基IC50为10 mg/mL，美拉德产物清除DPPH自由基IC50为0.4 mg/mL，酶解物经美拉德反应后，其对DPPH的清除自由基能力明显增强，提高了17～36倍，说明美拉德反应修饰是提高酶解肽抗氧化能力的一个有效的途径。

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Characterization of protein hydrolysates and its Maillard reaction products from scallopChlamysfarreriskirt

SUN Shiguang, LI Aoting, TANG Yue, SUN Na, YU Cuiping, WU Haitao

( 1.School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2.National Engineering Research Center of Seafood, Dalian Polytechnic University， Dalian 116034, China )

The enzymatic hydrolysates were prepared from scallopChlamysfarreriskirt using neutral and papaya proteases. The degree of hydrolysis (DH), molecular weight distribution, amino acids composition and DPPH scavenging capacities of hydrolysates and their Maillard reaction products (MRPs) were estimated. The results showed that DH of hydrolysates treated with neutral and papaya proteases could reach to 37.6% and 19.2% in the condition of 3 000 U/g enzyme dosage and 4% substrate concentration for 3 h. The molecular weights of the peptides in the enzymatic hydrolysates were mainly below 3 ku, in which papaya proteases of 59.7%-67.6% and neutral proteases of 64.5%-78.2%, respectively. DPPH scavenging capacities of enzymatic hydrolysates increased with the hydrolysis period, and IC50of the enzymatic hydrolysates decreased to 1/17-1/36 after reaction.

scallopChlamysfarreri; skirt; enzymatic hydrolysates; antioxidant; Maillard reaction

2016-03-15.

辽宁省自然科学基金项目(2014026017)；辽宁省科学技术计划项目(2015103020).

孙世广(1990-)，男，硕士研究生;通信作者：吴海涛(1980-)，女，副教授.

TS254.9

A

1674-1404(2017)04-0240-05

孙世广,李傲婷,唐越,孙娜,于翠平,吴海涛.栉孔扇贝裙边酶解物及其美拉德产物特性[J].大连工业大学学报,2017,36(4):240-244.

SUN Shiguang, LI Aoting, TANG Yue, SUN Na, YU Cuiping, WU Haitao. Characterization of protein hydrolysates and its Maillard reaction products from scallopChlamysfarreriskirt[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(4): 240-244.