白头翁皂苷糖基水解Ⅱ型酶的分离纯化及酶性质

代 蕊， 刘 春 莹， 徐 龙 权， 林 完 泽， 鱼 红 闪

( 1.大连工业大学 生物工程学院， 辽宁 大连 116034；2.韩京国立大学 生命科学学院， 京畿道 安城 456-749 )

白头翁皂苷糖基水解Ⅱ型酶的分离纯化及酶性质

代 蕊1， 刘 春 莹1， 徐 龙 权1， 林 完 泽2， 鱼 红 闪1

( 1.大连工业大学 生物工程学院， 辽宁 大连 116034；2.韩京国立大学 生命科学学院， 京畿道 安城 456-749 )

对Absidiasp. P39r所产白头翁皂苷糖基水解Ⅱ型酶(PSGaseⅡ)进行分离纯化，得到电泳纯酶蛋白，对其酶学性质以及该酶对底物的催化反应过程进行了研究。结果表明，该酶蛋白的分子质量为56 ku，最适反应pH为4.0，在pH 3.0～7.0酶活力稳定；最适反应温度为40 ℃，在20～40 ℃酶活力稳定；金属离子Na+、K+、Mg2+对酶反应无显著影响，而Fe3+、Cu2+、Zn2+对其有较强的抑制作用。酶反应动力学参数Km为19.60 mmol/L，vmax为21.60 mmol/(L·h)。PSGaseⅡ对白头翁皂苷PSⅠ的催化反应过程结果表明反应是分步进行的，PSGaseⅡ以白头翁皂苷PSⅠ为底物，先催化降解为中间产物白头翁皂苷PSⅡ，继续催化反应，最终生成白头翁皂苷A。

白头翁皂苷；水解酶；酶性质

0 引 言

白头翁具有清热解毒、燥湿杀虫等功效[1]，近年来，其增强系统免疫及抗肿瘤作用成为研究热点[2]。对白头翁的成分研究最多的是白头翁皂苷，其为白头翁的主要化学成分[3]，天然存在的白头翁皂苷大多含有多个糖基[4]，进入人体后需要被肠道内微生物转化为低糖基皂苷后可被人体吸收利用，若在体外实现这一过程，可提高皂苷的生物活性和利用度[5]。研究表明，生物酶法相对于化学法水解糖基更加温和，加之选择性较高，副产物少，成为主要的转化方法[6]。

目前，对于白头翁皂苷的研究主要集中在抗菌、抗阿米巴原虫、抗其他病原体等药理学方面[7-9],对白头翁皂苷糖基水解酶水解多糖基皂苷的研究较少。在前期研究中，筛选到Absidiasp. P39r菌，发酵产粗酶液可将六糖基的白头翁皂苷H3转化为二糖基的白头翁皂苷A[10]。对该菌产粗酶液进行分离纯化，得到分子质量为40 ku的电泳纯酶蛋白[5]，后期进一步的研究发现，40 ku的酶只是将白头翁皂苷H3转化为五糖基的白头翁皂苷(PSⅠ)，而最终产物白头翁皂苷A是以PSⅠ为底物，在另一种酶的催化下转化而来。为便于区分，实验室暂命名40 ku的酶为白头翁皂苷糖基水解Ⅰ型酶(PSGaseⅠ)，以PSⅠ为底物催化反应生成白头翁皂苷A的酶为白头翁皂苷糖基水解Ⅱ型酶(PSGaseⅡ)。

本实验针对PSGaseⅡ进行分离纯化，对其酶学性质和该酶对底物的催化反应进行研究，进一步阐明多糖基白头翁皂苷酶水解生成最终产物的反应过程，为今后进一步研究白头翁皂苷H3催化转化为白头翁皂苷A的双酶协同反应机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 种

Absidiasp. P39r，大连工业大学生物工程学院菌种保藏室。

1.1.2 试剂与仪器

3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元28-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷，暂命名为白头翁皂苷PSⅠ；3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷，暂命名为白头翁皂苷PSⅡ；3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元，白头翁皂苷A，均为本实验室制备[11]。

低分子质量标准蛋白，北京索莱宝科技有限公司；所有试剂均为分析纯。JM-250蛋白电泳仪，大连捷迈科贸有限公司；薄层层析，Silica Gel-60F254，德国Merck公司。

1.2 方 法

1.2.1 培养基的配制

白头翁粉80 g，加水400 mL，水浴6 h；过滤，4 ℃、8 000 r/min离心8 min。将离心得到的上清液补水至300 mL备用。

将4 mL白头翁浸出液与16 mL 6°麦汁混匀，制成PSGaseⅡ液体发酵培养基。

1.2.2 产酶菌株的发酵及粗酶液的提取

将Absidiasp. P39r菌接种到发酵培养基中，置于恒温振荡培养箱中培养6 d，培养条件为30 ℃、150 r/min。

将发酵好的菌体培养基于4 ℃、7 000 r/min离心10 min去除菌体，在4 ℃磁力搅拌条件下，缓慢加入研磨好的硫酸铵粉末，至75%饱和度。将饱和溶液于4 ℃保存12 h，12 000 r/min离心20 min。收集得到蛋白沉淀，并用20 mmol/L pH 5.0的HAc-NaAc缓冲液将沉淀溶解。对该溶液进行透析，每隔4 h换一次透析液，透析24 h。将透析液离心8 min，离心条件为4 ℃、7 000 r/min。得到的上清液即为粗酶液，放入4 ℃ 冰箱内保存备用。

1.2.3 粗酶的分离纯化

采用DEAE-Cellulose DE52阴离子交换柱(Φ2 cm×12 cm)对粗酶液进行分离纯化。用100 mL pH 5.0的HAc-NaAc缓冲液洗脱12 mL 粗酶液，再分别用60、90、120、150、180 mmol/L的氯化钾溶液进行梯度洗脱，自动分部收集器收集洗脱液，每3 min收集一管，每管3 mL。洗脱液在280 nm紫外光下测定OD。

1.2.4 酶蛋白分子质量的测定

采用SDS-PAGE法测定提纯酶的纯度及分子质量。所选用标准蛋白为磷酸酶b(97.4 ku)、牛血清蛋白(66.2 ku)、肌动蛋白(43 ku)、碳酸酐酶(31 ku)、胰蛋白酶抑制(22 ku)、溶菌酶(14.4 ku)。

1.2.5 酶活力的测定

利用TLC法对酶活力进行检测。将2 mg白头翁皂苷PSⅠ用1 mL 20 mmol/L的pH 5.0的HAc-NaAc缓冲液溶解，配制成2 mg/mL的底物。取100 μL PSGaseⅡ与底物等体积充分混合，40 ℃条件下反应24 h后，加入200 μL水饱和正丁醇终止反应，离心取上层液体作为TLC检测的样品，展开剂为体积比6.5∶4.5∶0.5的氯仿-甲醇-水溶液，10%硫酸显色。通过BandScan软件对酶反应产物进行定量分析。酶活力定义：在40 ℃条件下，每小时水解1 μmol底物所需的酶量为一个酶活力单位。

2 结果与讨论

2.1 粗酶液酶活力检测

将Absidiasp. P39r产酶菌发酵得到的含有PSGaseⅡ的粗酶液进行酶活力检测。取100 μL PSGaseⅡ与等体积2 mg/mL的白头翁皂苷PSⅠ混合，在40 ℃下反应24 h后，用TLC检测，结果如图1所示。从图1中可以看到，粗酶液可将底物PSⅠ转化生成最终产物白头翁皂苷A和少量白头翁皂苷PSⅡ，具有较强的酶活力。说明提取的粗酶液中含有较高活力的PSGaseⅡ，可用于离子交换柱层析法进行纯化。

图1 TLC检测含有PSGaseⅡ的粗酶液酶活力

2.2 粗酶的分离纯化

按“1.2.3”的方法对粗酶进行分离纯化，取每个洗脱梯度的出峰试管酶液进行酶反应后，利用150 mmol/L氯化钾溶液对洗脱酶液进行酶反应，TLC检测结果如图2所示。由图2可以看出，109号收集管中的酶液具有较好的酶活力，可以更加彻底地对底物进行水解，得到更多的反应产物。

S，底物；107～111，收集管编号

2.3 PSGaseⅡ纯度检测及其分子质量的测定

利用SDS-PAGE法对分离纯化得到的109号收集管的酶液进行纯度检测及分子质量测定，结果如图3所示。由图3可知，第109号收集管为电泳单带，可认定其为电泳纯的PSGaseⅡ。

图3 纯化的PSGaseⅡ SDS-PAGE图

由图3的标准蛋白及其相对迁移率绘制出蛋白质相对分子质量标准曲线，得到回归方程lgY=2.085 0-1.030 6X，将PSGaseⅡ在电泳图中的相对迁移率代入回归方程，计算出其分子质量约为56 ku。

2.4 酶学性质

2.4.1 温度对酶反应的影响

取100 μL PSGaseⅡ与2 mg/mL白头翁皂苷PSⅠ等体积混合，在pH为5的条件下，分别置于20、30、40、50、60、70、80 ℃的恒温箱中，反应24 h后，绘制最适反应温度曲线。

取100 μL PSGaseⅡ分别置于20、30、40、50、60、70、80 ℃条件下保存1 h，冷却至室温，与2 mg/mL 白头翁皂苷PSⅠ等体积混合，置于40 ℃ 恒温箱中，反应24 h后，绘制温度的稳定性曲线。

PSGaseⅡ的最适反应温度及温度稳定性曲线如图4所示。由图4可以看出，PSGaseⅡ在20～40 ℃，随着温度的升高酶活性增强，在40 ℃时达到最高，之后随着温度的升高酶活力下降。因此PSGaseⅡ的最适温度是40 ℃，在20～40 ℃保持稳定。

2.4.2 pH对酶反应的影响

将2 mg/mL的白头翁皂苷PSⅠ与100 μL PSGaseⅡ等体积混合，将反应体系的pH分别调至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。在40 ℃ 的恒温箱中反应24 h，绘制最适反应pH曲线。

图4 PSGaseⅡ的最适反应温度及温度稳定性曲线

Fig.4 The curves of optimum temperature and temperature stability of PSGaseⅡ

将PSGaseⅡ分别在pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的条件下，置于4 ℃保存1 h，与2 mg/mL的白头翁皂苷PSⅠ等体积混合，置于40 ℃恒温箱中，反应24 h后，绘制pH稳定性曲线。

PSGaseⅡ的最适反应pH及pH稳定性曲线如图5所示。

图5 PSGaseⅡ的最适反应pH及pH稳定性曲线

由图5可以看出，PSGaseⅡ在pH 3.0～7.0，酶活力较高，在pH为4.0时达到最高，所以PSGaseⅡ的最适pH为4.0，在pH 3.0～7.0酶活性稳定。

2.4.3 金属离子对酶反应的影响

分别向PSGaseⅡ与2 mg/mL的白头翁皂苷PSⅠ等体积混合反应体系中加入5、10、50、100、200 mmol/L的K+、Mg2+、Na+、Fe3+、Cu2+、Zn2+，根据方法“1.2.5”测定其酶活力，结果如表1所示。由表1可看出，K+、Mg2+、Na+对酶活力影响较小；Fe3+、Cu2+、Zn2+在浓度较低时影响较小，随着浓度的升高抑制作用逐渐增强。

表1 金属离子对相对酶活力的影响

2.4.4 PSGaseⅡ的酶反应动力学方程

配制不同浓度的底物与等体积的PSGaseⅡ在40 ℃、pH 5.0条件下反应1 h，采用Lineweaven-Burk 作图，得到PSGaseⅡ的米氏方程：1/v=2.78+54.4/S，Km=19.60 mmol/L，vmax=21.60 mmol/(L·h)。

2.5 PSGaseⅡ对白头翁皂苷PSⅠ的催化反应

取1 mL PSGaseⅡ与2 mg/mL白头翁皂苷PSⅠ等体积混合，在40 ℃下分别反应4、8、12、16、18、22、24 h，进行TLC检测，结果如图6所示。

图6 白头翁皂苷PSⅠ的酶反应TLC结果

由图6可看出，PSGaseⅡ对底物白头翁皂苷PSⅠ的催化反应过程中，经过4 h时，PSⅠ并没有明显的转化；反应到8 h时，有微量PSⅠ转化为白头翁皂苷PSⅡ；反应12 h时，50%左右的PSⅠ 转化生成白头翁皂苷PSⅡ；反应16 h时，80%的PSⅠ转化为白头翁皂苷PSⅡ和少量白头翁皂苷A；反应18 h时，PSⅠ全部被转化生成PSⅡ 和白头翁皂苷A，其中PSⅡ的生成量明显减小；反应进行到22 h时，PSⅠ全部被转化生成终产物白头翁皂苷A；到24 h，PSⅠ的转化终产物白头翁皂苷A有少量的增加。

由此可见，PSGaseⅡ催化底物白头翁皂苷PSⅠ，先水解白头翁皂苷PSⅠ的28-O-末端葡萄糖基和3-O-末端葡萄糖基生成中间过渡产物白头翁皂苷PSⅡ，再进一步水解白头翁皂苷PSⅡ的28-O-葡萄糖酯键，生成终产物白头翁皂苷A。

3 结 论

经Absidiasp. P39r菌株发酵，得到了含有PSGaseⅡ高活力的粗酶液，利用DEAE-Cellulose DE52阴离子交换柱分离纯化得到了电泳纯的PSGaseⅡ，确定了该酶的分子质量为56 ku。该酶的最适反应pH为4.0，在pH 3.0～7.0较稳定。最适反应温度为40 ℃，在20～40 ℃条件下酶活力相对稳定。金属离子K+、Mg2+、Na+对酶反应无显著影响；而Fe3+、Cu2+、Zn2+对其有较强的抑制作用。动力学方程为1/v=2.78+54.4/S，Km=19.60 mmol/L，vmax=21.60 mmol/(L·h)。PSGaseⅡ 对底物的催化反应过程分两步进行：以白头翁皂苷PSⅠ为底物，先催化降解两分子葡萄糖，形成中间过渡产物白头翁皂苷PSⅡ，然后继续催化降解28-O-末端酯键上的一分子葡萄糖，最终生成白头翁皂苷A。

从TLC图谱可以看到，PSGaseⅡ转化底物白头翁皂苷PSⅠ的效率很高，22 h能将底物彻底转化成低糖基的白头翁皂苷A。酶反应过程研究表明，该酶既能水解葡萄糖苷键，也能水解葡萄糖酯键，对于这种特异性的水解酶，其反应机制还有待于在分子水平进行更深入的研究。

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Purification and properties of pulchinenoside glycosyl hydrolase Ⅱ

DAI Rui, LIU Chunying, XU Longquan, LIN Wanze, YU Hongshan

( 1.School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2.School of Life Science, Hankyong National University, Anseong 456-749, Korea )

The pulchinenoside glycosyl hydrolase Ⅱ (PSGaseⅡ) fromAbsidiasp. P39r was purified and characterized. Its molecular weight was 56 ku. The optimum pH was at pH 4 and the enzyme was stable at pH 3.0-7.0. The optimum temperature was 40 ℃ and the enzyme was stable at 20-40 ℃. Ions Na+, K+and Mg2+had no effects on the enzyme activity of PSGaseⅡ, but Fe3+, Cu2+and Zn2+had strong inhibitory effects on the enzyme reaction. Under the optimum conditions,Kmwas 19.60 mmol/L and the maximum reaction rate was 21.60 mmol/(L·min). Pulchinenoside PSⅠ was enzymatic hydrolyzed to pulchinenoside PSⅡ and then to pulchinenoside A by PSGaseⅡ.

pulchinenoside; hydrolase; enzyme properties

2015-12-18.

“重大新药创制”科技重大专项(2012ZX09503001-003)；国家高端外国专家项目(GDT20152100019).

代 蕊(1990-)，女，硕士研究生；通信作者：鱼红闪(1968-)，男，教授.

TS201.2；Q556.2

A

1674-1404(2017)04-0245-05

代蕊,刘春莹,徐龙权,林完泽,鱼红闪.白头翁皂苷糖基水解Ⅱ型酶的分离纯化及酶性质[J].大连工业大学学报,2017,36(4):245-249.

DAI Rui, LIU Chunying, XU Longquan, LIN Wanze, YU Hongshan. Purification and properties of pulchinenoside glycosyl hydrolase Ⅱ[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(4): 245-249.