从三七茎叶皂苷中分离纯化人参皂苷C-Mx1和Rb3

陈 双, 刘 春 莹, 王 亚 芳, 鱼 红 闪, 金 凤 燮

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034 )

从三七茎叶皂苷中分离纯化人参皂苷C-Mx1和Rb3

陈 双, 刘 春 莹, 王 亚 芳, 鱼 红 闪, 金 凤 燮

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034 )

利用两步硅胶柱层析法，从三七茎叶皂苷中分离纯化人参皂苷Rb3和C-Mx1单体。30 g三七茎叶皂苷，经分离得到纯度为50%～60%的粗品C-Mx1 4.66 g和Rb3 8.58 g；将C-Mx1和Rb3粗品皂苷进行二次硅胶柱分离，得到纯度为95%的C-Mx1单体0.92 g和Rb3单体3.1 g。以核磁共振法证明了分离产物为C-Mx1和Rb3皂苷。

人参皂苷C-Mx1；人参皂苷Rb3；三七茎叶皂苷

0 引 言

三七的主要活性成分为皂苷，已发现三七中有人参皂苷70余种，其中三七根中90%以上的皂苷为Rg1、Rb1和Re人参皂苷，三七茎叶中含有Rb3、C-Mx1、Rc、Rb1等几十种皂苷[1-2]。目前人参茎叶的药用功效已进入药典，但三七茎叶的药用功效仍未进入药典，且利用率很低。三七茎叶皂苷Rb3、C-Mx1等在治疗心血管疾病和神经系统方面具有较高的功效[3-4]。

目前，有关从三七茎叶中分离皂苷单体的报道很多。饶高雄等[5]用硅胶柱、Rp-18柱、葡聚糖凝胶LH-柱等三步柱层析方法，从100 g三七茎叶皂苷中分离得到2.1 g人参皂苷Rb3；韩金玉等[6]采用大孔吸附树脂法和正相液相色谱法，建立了人参皂苷Rb3的制备工艺，得到Rb3的纯度为90%；刘翀等[7]以三七茎叶提取物为原料，采用反相液相色谱技术分离纯化人参皂苷Rb3，得到了纯度为90%的Rb3；还有利用胶束电动色谱法等方法分离单体皂苷的报道[8]；但是，这些方法步骤烦琐，或者需要昂贵的仪器设备。

本实验利用最通常的硅胶柱、改变洗脱剂极性等方法，从三七茎叶皂苷中分离提纯C-Mx1和Rb3皂苷单体，并用核磁共振方法核对了其化学结构，为大量制备C-Mx1和Rb3皂苷单体提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

三七茎叶皂苷，辽宁桓仁阳光保健品有限公司；人参皂苷标准品Fa、Fc、Rb1、Rc、Rb3、Rd、Gyp17、C-Mc1、C-Mx1等，天津天宿光华、天乐集团；薄层层析板Silica gel 60-F254，德国Merck公司；硅胶，青岛海洋化工厂。

1.2 方 法

1.2.1 硅胶柱分离三七茎叶皂苷

第一次硅胶柱分离：向30 g的三七茎叶皂苷中加20 mL体积比为9∶1的氯仿-甲醇混合液，再加入80～100目硅胶75 g(样品质量的2.5倍)，搅拌均匀；装入300～400目硅胶550 g(样品质量的16～20倍)作分离胶，上面装入样品胶。

先用1～2 L纯氯仿通柱，然后用体积比为7.5∶2.5∶0.2的氯仿-甲醇-水洗脱剂洗脱硅胶柱，用三角瓶分别收集洗脱液，每瓶200 mL，依次标记好瓶号；用TLC方法检测洗脱液，分别合并C-Mx1 和Rb3；减压蒸干，得到C-Mx1和Rb3粗品。

第二次硅胶柱分离：将C-Mx1和Rb3粗品，按相同方法制备样品胶，装硅胶柱；用极性略低的洗脱液，分别洗脱分离单体皂苷。

C-Mx1皂苷的分离：用体积比为8∶2的氯仿-甲醇洗脱剂洗脱，用250 mL三角瓶分别收集洗脱液(150～200 mL)，洗脱至不再含有C-Mx1皂苷；用TLC检测，合并C-Mx1纯单点的洗脱液，蒸干得到C-Mx1单体。

Rb3皂苷的分离：用体积比为7.8∶2.2∶0.1 的氯仿-甲醇-水洗脱剂洗脱，收集方法与C-Mx1 方法相同。

1.2.2 薄层层析法(TLC)

用毛细管吸取标准品及样品皂苷溶液，在薄层层析板上点样、吹干。展开剂为体积比7∶3∶0.5的氯仿-甲醇-水，用10%硫酸加热显色。

1.2.3 高效液相色谱法(HPLC)

人参皂苷标准品制备：分别称取1 mg人参皂苷标准品Fa、Rb1、Fc、Rc、Rb3、Rd、Gyp-17、C-Mc1、C-Mx1，溶于1 mL甲醇中，配制成人参皂苷标准品溶液。

色谱仪，Waters 2695高效液相色谱分析仪，Waters 2996二极管阵列检测器及Empower色谱工作站进行检测。Knauer C18色谱柱(5 μm， 250 mm×3 mm)；流动相：乙腈(A)-水(B)；0～20 min，20% A等度；20～31 min，20%～32% A线性梯度；31～40 min，32%～43% A线性梯度；40～70 min，43%～100% A线性梯度；进样量，10 μL；柱温，35 ℃；体积流量，0.6 mL/min；检测波长，203 nm。

1.2.4 核磁共振法(NMR)

将三七茎叶皂苷所分离的单体皂苷，用核磁共振(NMR)法检测其化学结构。NMR波谱，采用瑞士Bruke AVANCE 600超导核磁共振波普仪进行测定；1H NMR谱的观测频率为600 MHz，13C NMR谱的观测频率为150 MHz；探头，5 mm BBO；溶剂，Pyridine-D5[9]。

2 结果与讨论

2.1 市销三七茎叶皂苷成分分析

称取三七茎叶皂苷4 mg，溶于1 mL色谱纯甲醇中，经HPLC检测，与人参皂苷标准品Fa、Fc、Rb1、Rc、Rb3、Rd、Gyp17、C-Mc1、C-Mx1相比较，结果如图1所示。

图1 三七茎叶皂苷的HPLC

从图1可以看到，市销的三七茎叶皂苷中，主要含人参二醇类皂苷Fa、Fc、Rb1、Rc、Rb3、Rd、Gyp17、C-Mc1、C-Mx1等，人参三醇类皂苷含量较低。图1的各皂苷含量如表1所示。

由图1和表1可知，三七茎叶皂苷中含量最高的皂苷为Rb3(30%)，其次是C-Mx1(17%)，因此，可以通过硅胶柱法从三七茎叶皂苷中分离Rb3和C-Mx1单体。

2.2 硅胶柱分离纯化C-Mx1和Rb3

2.2.1 C-Mx1和Rb3粗品的分离

用体积比为7.5∶2.5∶0.2的氯仿-甲醇-水洗脱剂进行洗脱，共收集79瓶，合并得到11种物质。1，1～28瓶，3.18 g；2，29～30瓶，0.32 g；3，31～36瓶，1.36 g；4，37～42瓶，2.75 g；5，43～45瓶，1.91 g；6，46～51瓶；7，52瓶，0.75 g；8，53瓶，3.08 g；9，56～65瓶，5.50 g；10，66～73瓶，3.08 g；11，74～79瓶，2.06 g。经TLC检测，结果如图2所示。

表1 HPLC检测三七茎叶中不同皂苷的出峰时间及峰面积比

Tab.1 Different ginsennoside contents in notoginseng leaf determined by HPLC

皂苷t/min峰面积比/%1Fa36．1026．862Rb137．1484．893Fc37．64514．364Rc37．99311．165Rb338．77130．126Rd40．3522．667Gyp1741．2872．058C-Mc142．4895．889C-Mx143．21717．18

原，三七茎叶皂苷；Rb3、C-Mx1，Rb3、C-Mx1标准品

从图2中可以看到，分离物4和5中，C-Mx1皂苷含量最高，分别为2.75和1.91 g，共4.66 g；分离物7、8、9中Rb3含量最高，共8.58 g；即得到C-Mx1粗品4.66 g、Rb3粗品8.58 g。

C-Mx1粗品和Rb3粗品经HPLC检测，如图3所示。经计算，C-Mx1和Rb3皂苷纯度均为50%，质量分别为2.33和4.29 g。

2.2.2 C-Mx1和Rb3单体的分离

按“1.2.1”方法分别分离纯化C-Mx1和Rb3，得到0.92 g C-Mx1单体和3.1 g Rb3单体，得率为3.1%和10%。经检测，纯度均为95%，HPLC结果如图4所示。

2.3 NMR鉴定C-Mx1和Rb3的化学结构

对分离得到的人参皂苷C-Mx1和Rb3分别进行1H NMR、13C NMR等核磁共振图谱检测。

(a) C-Mx1

(b) Rb3

图3 从三七茎叶皂苷分离的C-Mx1粗品和Rb3粗品的HPLC

Fig.3 Crude C-Mx1 and Rb3 from notoginseng leaf ginsenosides determined by HPLC

(a) C-Mx1

(b) Rb3

图4 经分离提纯的C-Mx1和Rb3单体的HPLC

Fig.4 HPLC of pure ginsenoside C-Mx1 and Rb3 from notoginseng leaf ginsenosides

通过与文献[10-11]中人参皂苷核磁数据比对分析，确认了从三七茎叶皂苷分离得到的人参皂苷的化学结构，证明了分离得到的产物为人参皂苷C-Mx1和Rb3单体。13C NMR数据及其结构归属如表2所示。由表2可以确认，从三七茎叶皂苷分离得到物质是人参皂苷C-Mx1和Rb3单体，其化学结构式如图5所示。

因此，人参皂苷C-Mx1系统名称为3-O-β-D-glucopyranosyl-20-O-[β-D-xylopyranosyl-(1→6)- β-D-glucopyranosyl]-20(S)-protopanaxadiol。中文名称为3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基]-20-O-[β-D-吡喃木糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基]-20(S)-人参二醇苷元。

Rb3的系统命名称为3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl]-20-O-[β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl]-20(S)- protopanaxadiol。中文为3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基]-20-O-[β-D-吡喃木糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基]-20(S)-人参二醇苷元。

表2 分离纯化的人参皂苷C-Mx1和Rb3的13C NMR数据及其结构归属

(a) C-Mx1

(b) Rb3

图5 C-Mx1和Rb3单体皂苷结构式

Fig.5 Structures of pure ginsenoside C-Mx1 and Rb3

3 结 论

市销的三七茎叶皂苷中主要含有皂苷Fa、Fc、Rb1、Rc、Rb3、Rd、Gyp17、C-Mc1、C-Mx1等，其中含量最高的皂苷为Rb3，其次为C-Mx1皂苷。从30 g三七茎叶皂苷中，成功地分离得到纯度95%的C-Mx1单体皂苷0.92 g，得率为3.1%；分离得到纯度95%的Rb3单体皂苷3.1 g，得率为10%。用NMR法鉴定了产物的化学结构，确认其为人参皂苷单体C-Mx1和Rb3。

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Separated and purified ginsenoside C-Mx1 and Rb3 from notoginseng leaf ginsenosides

CHEN Shuang, LIU Chunying, WANG Yafang, YU Hongshan, JIN Fengxie

( School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

The ginsenoside C-Mx1 and Rb3 were isolated and purified from notoginseng leaf ginsenosides. 30 g notoginseng leaf ginsenosides were isolated, from which 50%-60% crude C-Mx1 of 4.66 g and Rb1 of 8.58 g were obtained. 95% pure C-Mx1 of 0.92 g and Rb3 of 3.1 g were obtained from 4.66 g crude C-Mx1 and 8.58 g crude Rb3. The separation products were C-Mx1 and Rb3 saponins determined by13C NMR.

ginsenoside C-Mx1; ginsenoside Rb3; notoginseng leaf ginsenosides

2015-12-30.

“重大新药创制”科技重大专项(2012ZX09503001-003)；国家高端外国专家项目(GDT20152100019).

陈 双(1991-)，女，硕士研究生；通信作者：鱼红闪(1968-)，男，教授.

TS201.2

A

1674-1404(2017)04-0255-05

陈双,刘春莹,王亚芳,鱼红闪,金凤燮.从三七茎叶皂苷中分离纯化人参皂苷C-Mx1和Rb3[J].大连工业大学学报,2017,36(4):255-259.

CHEN Shuang, LIU Chunying, WANG Yafang, YU Hongshan, JIN Fengxie. Separated and purified ginsenoside C-Mx1 and Rb3 from notoginseng leaf ginsenosides[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(4): 255-259.