γ干扰素释放试验检测颈部淋巴结细胞悬液辅助诊断颈部淋巴结结核的初步报告

2017-08-07 06:56许辉闫广鹏马晶夏志刚唐晖李军
中国防痨杂志 2017年8期
关键词:悬液结核结核病

许辉 闫广鹏 马晶 夏志刚 唐晖 李军



·论著·

γ干扰素释放试验检测颈部淋巴结细胞悬液辅助诊断颈部淋巴结结核的初步报告

许辉 闫广鹏 马晶 夏志刚 唐晖 李军

目的 评估γ干扰素释放试验(IGRA)检测颈部淋巴结细胞悬液对颈部淋巴结核的辅助诊断价值。方法 将2015年1月至2016年5月在新疆维吾尔自治区人民医院收治的48例颈部淋巴结肿大患者采用复合诊断标准分为颈部淋巴结结核组(21例),非颈部淋巴结结核组(27例),对48例患者的外周血和颈部淋巴结细胞悬液进行γ干扰素释放试验检测,运用SPSS 19.0软件进行数据分析,两组间斑点形成细胞(SFCs)个数的比较采用Mann-WhitneyU检验,样本间率的比较采用χ2检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果 IGRA检测颈部淋巴结细胞悬液和外周血的敏感度分别为90.48%(19/21)、95.24%(20/21),差异无统计学意义(χ2=0.00,P>0.05),颈部淋巴结细胞悬液和外周血的特异度分别为70.37%(19/27)、92.59%(25/27),差异有统计学意义(χ2=4.43,P<0.05)。颈部淋巴结结核组中IGRA检测外周血和颈部淋巴结细胞悬液的SFCs中位数及上下四分位数[M(Q1,Q3)]分别为109(52,186)个、68(30,156)个,不同标本间检测的SFCs中位数差异无统计学意义(U=175.00,P>0.05)。非颈部淋巴结结核组中IGRA检测外周血和颈部淋巴结细胞悬液的SFCsM(Q1,Q3)分别为0(0,18)个、0(0,3) 个,不同标本间检测的SFCs中位数差异无统计学意义(U=271.00,P>0.05)。颈部淋巴结结核组的淋巴结细胞悬液SFCs明显高于非颈部淋巴结结核组的淋巴结细胞悬液SFCs,差异有统计学意义(U=45.00,P<0.05)。结论 γ干扰素释放试验检测颈部淋巴结细胞悬液具有可行性,对颈部淋巴结结核的辅助诊断有一定的价值。

结核, 淋巴结; 标本制备; 酶联免疫斑点检测; 干扰素γ; 敏感性与特异性

新疆是中国结核病疫情较为严重的地区,2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查显示,全国15岁及以上人群活动性肺结核的患病率为459/10万,而新疆地区15岁以上人群标化活动性肺结核患病率为1526.12/10万[1-2],明显高于全国平均水平。颈部淋巴结结核作为一种常见的肺外结核,在该地区的发病率也处于较高水平。结核分枝杆菌培养作为颈部淋巴结结核的确认性诊断,该检查手段特异度高但敏感度低,其阴性结果也无法排除结核分枝杆菌感染,并且结核分枝杆菌培养周期长达数周,给及时确诊颈部淋巴结结核带来了困难。颈部淋巴结穿刺活检作为一种微创的检查手段,因其提取的组织量有限往往需要结合其他辅助诊断做出综合判断[3]。切取颈部淋巴结进行组织病理学检查也是目前临床上常用的确诊颈部淋巴结结核的方法,但抗酸染色阳性率低[4],有时难以与其他淋巴结肉芽肿病病变相鉴别。因此,有时颈部淋巴结结核的诊断需要综合影像学检查、临床表现,以及细胞学和组织病理学检查做出综合判断[5-6]。γ干扰素释放试验(γ-interferon release assay,IGRA)通过将2种结核分枝杆菌特异性抗原[早期分泌靶向抗原6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)]做为刺激原去刺激外周血中致敏淋巴细胞,定量检测经过抗原刺激后分泌γ干扰素的相关效应T细胞数量来判断是否存在结核分枝杆菌的感染,已被广泛应用于结核病的辅助诊断。中国属于结核病的高负担国家,运用IGRA对我国不同人群所做的结核潜伏感染调查显示,结核潜伏感染率为13%~33.6%[7-9]。因此,在新疆这一结核病高负担地区,IGRA对颈部淋巴结结核的辅助诊断价值必然受到该地区较高结核潜伏感染的影响。我们尝试运用IGRA对颈部肿大淋巴结的细胞悬液进行检测,探讨该方法对颈部淋巴结结核的辅助诊断价值。

资料和方法

一、研究对象

选择2015年1月至2016年5月新疆维吾尔自治区人民医院收治的48例颈部淋巴结病变患者,研究对象的入选标准是以颈部淋巴结肿大为诊断收治的新疆本地常住居民患者,患者需要并同意行颈部淋巴结活检。

排除标准:伴有未经治愈的肺结核和(或)除外颈部淋巴结结核的肺外结核病变;接受免疫调节治疗,无病理学或细菌学检查结果而临床诊断为颈部淋巴结结核,原发灶明确的颈部转移癌。

依据组织病理学和(或)微生物学诊断结果将患者分为颈部淋巴结结核组和非颈部淋巴结结核组。

颈部淋巴结结核组有21例,其中女14例,男7例,年龄中位数及上下四分位数[M(P25,P75)]为35(15,76)岁。

非颈部淋巴结结核组27例,其中女13例,男14例,年龄M(P25, P75)为46(17,78)岁,该组颈部淋巴结病变包括:颈部淋巴结反应性增生24例,颈部神经鞘瘤并发颈部淋巴结反应性增生1例,颈部淋巴结转移癌1例,滤泡性淋巴瘤1例。

所有研究对象签署知情同意书,本研究经过新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会审查并被核准执行。

二、方法

1. 外周血结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)检测:选择T-SPOT.TB试剂盒(Oxford Immunotec公司产品)进行IGRA检测。以肝素抗凝真空采血管采集患者8 ml的外周静脉血,置于室温环境内并于4 h内进行外周血单个核细胞分离,并制备成浓度为2.5×106个/ml的单个核细胞悬液。50 μl细胞培养液加入到空白对照孔;将50 μl抗原B(CFP-10)加入至检测孔B;将50 μl抗原A(ESAT-6)加入至检测孔A;将50 μl阳性对照(植物血凝素,PHA)加入至阳性对照孔。然后在预包被好γ干扰素抗体的平板中,每孔依次加入100 μl浓度为2.5×106个/ml的单个核细胞悬液。 放入CO2培养箱(37 ℃,5% CO2)培养16~20 h。先根据标本量计算好酶结合物工作液所需的量,以1∶200的比例将酶结合物原液与磷酸盐缓冲液(PBS)混合,制成酶结合物工作液,每孔加50 μl,4~8 ℃孵育1 h。每孔用200 μl PBS液洗涤4次,拍干,然后加显色液50 μl,暗处静置7 min,用蒸馏水终止反应。将板孔内液体拍干,晾至底膜干透后行斑点形成细胞(SFCs)个数读取,并记录报告结果。

阳性结果判断标准为:空白对照孔SFCs个数为 0~5 个、且抗原 A 或抗原 B 孔的SFCs个数-空白对照孔SFCs个数≥6个;空白对照孔SFCs个数为 6~10 个、且抗原 A 或抗原 B 孔的SFCs个数≥2×空白对照孔SFCs个数。阴性结果判断标准:如果不符合上述标准且阳性对照孔正常时,检测结果判断为阴性。若空白对照孔内SFCs个数≥10个或阳性对照孔内SFCs个数<20个,试验结果判断为无效试验。

2.淋巴结细胞悬液T-SPOT.TB检测:选择与外周血检测相同的试剂盒。淋巴细胞悬液制备所用器械用品均经过灭菌处理或为一次性无菌包装。颈部病变淋巴结均经手术摘取,如果颈部病变淋巴结发生液化则取临近肿大淋巴结。颈部淋巴结手术摘取后随即切取约0.5 cm3~1 cm3大小淋巴结组织,用以制备淋巴结细胞悬液,其余送病理检查。以生理盐水反复冲洗淋巴结后剥离并去除淋巴结包膜,随后置于15 ml玻璃匀浆器内加8 ml 0.9%氯化钠注射液制备匀浆,制备过程中缓慢用力至无肉眼可见淋巴结组织团块后以70 μm细胞过滤器过滤,抽取6 ml过滤后的淋巴结细胞悬液注入肝素抗凝真空采血管内,并于2 h内进入检测环节。检测前用注射器缓慢吸入上述悬液至离心管中,加入1640培养液至10 ml,以700×g离心7 min。弃上清液,重复此步骤一次。再加入1640培养液,定容到7~8 ml 左右,混匀,将该混悬液加到装有3~4 ml淋巴细胞分离液的离心管中,以1000×g离心22 min。将管中离心后的呈云雾状白膜的淋巴细胞层由上向下慢慢吸取加入到新的15 ml离心管中,并加1640培养液定容至10 ml,颠倒混匀一次后以600×g离心7 min。离心后尽快倒掉上清,先加少量 1640培养液,吹打将细胞打开,再加1640培养液至10 ml,混匀,以350×g离心7 min。离心后倒掉上清,加入500 μl AIM-V培养液,用移液器吹打重悬细胞沉淀,另取1.5 ml离心管,按标本号编号,离心管中加入100 μl细胞悬液+100 μl 1640培养液, 混匀后上机(三分类/五分类计数仪工程师模式)并行涂片人工计数复核。按照方案将每个标本的淋巴细胞数稀释至2.5×106个/ml。其余步骤及结果判定同外周血检测方案。阳性检测结果示例见图1。整个研究过程中由病理科医生及检验科医生独立做出结果判断。

空白对照:空白对照孔;阳性对照:PHA检测孔;抗原B:抗原CFP-10检测孔; 抗原A:抗原ESAT-6检测孔图1 颈部淋巴结细胞悬液IGRA检测阳性结果示例

3.统计学处理:运用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析,非正态分布的计量资料采用“M(Q1,Q3)”表示,两组样本间率的比较采用χ2检验, SFCs的比较用Mann-WhitneyU检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1. IGRA检测颈部淋巴结细胞悬液和外周血结果:IGRA检测颈部淋巴结细胞悬液和外周血的敏感度分别为90.48%(19/21),95.24%(20/21),两者差异无统计学意义(χ2=0.00,P>0.05);检测外周血和颈部淋巴结细胞悬液的特异度分别为70.37%(19/27)、92.59%(25/27),颈部淋巴结细胞悬液的特异度高于外周血,差异有统计学意义(χ2=4.43,P<0.05),详见表1。非颈部淋巴结结核组中有2例患者的外周血及淋巴结细胞悬液IGRA均为阳性。1例为颈部神经鞘瘤并发颈部淋巴结反应性增生患者(SFCs外周血为109个,淋巴组织悬液为 239个),另1例为滤泡性淋巴瘤患者(SFCs 外周血为114个,淋巴组织悬液为40个)。

颈部淋巴结结核组和非颈部淋巴结核组外周血及淋巴细胞悬液SFCs比较:颈部淋巴结结核组中IGRA检测外周血和颈部淋巴结细胞悬液的SFCs个数M(Q1,Q3)分别为109(52,186)个、68(30,156)个,两者差异无统计学意义(U=175.00,P>0.05)。非颈部淋巴结结核组中IGRA检测外周血和颈部淋巴结细胞悬液的SFCs个数M(Q1,Q3)分别为0(0,18)个、0(0,3)个,两者差异无统计学意义(U=271.00,P>0.05)。但颈部淋巴结结核组的淋巴结细胞悬液的SFCs个数明显高于非颈部淋巴结结核组,差异有统计学意义(U=45.00,P<0.05)。

讨 论

目前有2种IGRA检测方法:一种是采用酶联免疫吸附试验法,该方法检测全血中致敏淋巴细胞受到结核分枝杆菌特异性抗原刺激后释放的γ干扰素水平;另一种方法是采用酶联免疫斑点技术检测外周血单个核细胞中致敏淋巴细胞受到结核分枝杆菌特异性抗原刺激后释放的γ干扰素水平,两种检测方法的检验原理和效能相似[10]。因酶联免疫斑点技术检测的是经分离的单个核细胞,重点检测活细胞的功能[11],能排除悬液中其他成分对试验结果产生不可预测的影响,因此本研究采用酶联免疫斑点技术进行检测。

表1 48例患者颈部淋巴结细胞悬液和外周血进行IGRA检测的结果分析

注 敏感度(%)=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%;特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%;阳性预测值(%)=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%;阴性预测值(%)=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%;阳性似然比=敏感度/(1-特异度);阴性似然比=(1-敏感度)/特异度

2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告显示,新疆肺结核患者中男性是女性患病概率的1.31倍[12],而纳入本研究的颈部淋巴结结核病患者中女性患者较多(14/21),女性较男性更易患颈部淋巴结结核这一现象也被其他相关研究所证实[13-14],但相关原因仍有待进一步分析。

本研究中将分离后得到的颈部淋巴结组织单个核细胞和外周血单个核细胞浓度均调整为2.5×106个/ml,然后行IGRA检测。白雪娟等[15]采用IGRA检测结核性胸膜炎患者胸腔积液时发现,需要将分离得到的胸腔积液中单个核细胞的浓度进行重新调整,否则影响结果判定。而本研究采用制备相同浓度的外周血及颈部淋巴结组织单个核细胞进行IGRA检测,并未发现影响结果判定。然而,IGRA检测的γ-干扰素是由活化的 T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、树突状细胞、单核细胞组成的细胞群经结核特异性抗原刺激后分泌的[11],目前尚不清楚外周血单个核细胞和淋巴组织单个核细胞中上述细胞群在经结核特异性抗原刺激后的表现是否具有同质性,再加之本研究样本量的局限性,因此能否采用相同的临界值进行结果判断仍需更多的样本数据进行进一步研究来验证。

本研究中IGRA检测颈部淋巴结细胞悬液和外周血对诊断颈部淋巴结结核的特异度分别为92.59%、70.37%,IGRA检测颈部淋巴结细胞悬液诊断颈部淋巴结结核的特异度明显高于外周血检测结果(P<0.05)。我国新疆地区的结核病负担水平较高导致该地区存在较多的潜伏结核感染者,在本研究中非颈部淋巴结结核组外周血IGRA检测的阳性率为29.63%(8/27),这使得本研究中IGRA检测外周血对诊断颈部淋巴结结核的特异度较低。正常情况下机体在感染结核分枝杆菌后会产生相应的致敏T淋巴细胞,由于致敏T淋巴细胞有在结核感染区域富集的特性[16-17],被结核分枝杆菌感染的颈部淋巴结内富集有针对结核分枝杆菌的致敏淋巴细胞,通过提取颈部淋巴结细胞悬液中的单个核细胞进行IGRA检测可判断该淋巴结是否存在结核致敏淋巴细胞,从而判断该淋巴结是否存在结核分枝杆菌感染。因此,本研究中IGRA检测颈部淋巴结细胞悬液诊断结核病的特异度明显高于IGRA检测外周血。

纳入本研究的非颈部淋巴结结核病患者中有2例患者的外周血及淋巴结细胞悬液IGRA检测均为阳性。1例为颈部神经鞘瘤并发颈部淋巴结反应性增生患者(SFCs外周血检测为109个,淋巴组织悬液检测为 239个), 来自属于新疆结核病的高发区之一的和田地区,但否认与结核病患者有密切接触史,术后随访22个月未见颈部出现异常肿大淋巴结。另1例为滤泡性淋巴瘤患者,该患者2年前曾经病理活检确认为右颈部淋巴结结核,行抗结核药物治疗9个月,因左颌下淋巴结肿大血液科要求行切除活检,术后病理报告为滤泡性淋巴瘤,该患者SFCs外周血检测为114个,淋巴组织悬液检测为40个。颈部淋巴结结核的组织病理特征性病变是干酪样坏死及肉芽组织形成,但在这些特征性病变形成之前,结核分枝杆菌进入淋巴结后就会引起淋巴结内效应淋巴细胞针对结核分枝杆菌产生细胞免疫,即使淋巴结已被淋巴瘤细胞浸润,仍有相应的致敏淋巴细胞。而且,目前尚无诊断与鉴别诊断潜伏性结核感染和活动性结核病的金标准,IGRA可以用作检测结核感染的手段但不能区分潜伏性结核感染和活动性结核病[18],因此,即使淋巴结细胞悬液IGRA检测结果为阳性,因组织病理学缺乏特征性的病变或被其他病变所掩盖,这些淋巴结难以被病理学诊断为淋巴结结核。

在纳入本研究的颈部淋巴结结核患者中有2例患者的外周血IGRA结果为阳性而淋巴结细胞悬液IGRA为阴性。分析该2例患者的病历资料,发现其中1例患者的颈部淋巴结结核病变均发生大面积液化坏死并波及皮下组织,术中切取液化坏死区边缘部分的可疑颈部淋巴结病变组织制备淋巴结悬液,可能未切取到淋巴结组织或切取的有效淋巴结组织过少而导致阴性结果。另1例切取液化坏死区周围肿大颈部淋巴结标本的病理检查结果为淋巴结反应性增生,我们推测该淋巴结的增生不是由于感染了结核分枝杆菌而引起,而是淋巴结液化坏死后引起周围组织炎症从而引起的周围淋巴结反应性增生,因该淋巴结并未有结核分枝杆菌侵入而产生相应的致敏淋巴细胞,所以该淋巴结制备的淋巴结细胞悬液IGRA检测结果为阴性。但上述推测是否正确仍需要进一步验证。

IGRA通过检测颈部淋巴结细胞悬液中结核分枝杆菌致敏的淋巴细胞数量,起到了判断被检颈部淋巴结是否存在结核分枝杆菌感染的作用,弥补了外周血IGRA检测无法定位结核感染部位的不足,特别是当其他辅助方法提供的诊断证据不充分时,为颈部淋巴结结核的诊断可提供有力的支撑。但IGRA检测作为一种间接检测手段,并不能区分潜伏性结核感染和活动性结核病,也不能够检测结核分枝杆菌的数量,特别是怀疑颈部淋巴结肿瘤性病变并发结核分枝杆菌感染时,颈部淋巴结细胞悬液IGRA检测结果需要结合其他辅助诊断方法(如GeneXpert MTB/RIF[19]等方法)来综合判断是否为颈部淋巴结结核。

本研究采用颈部淋巴结细胞悬液进行IGRA检测也存在一定的局限性:由于颈部淋巴结标本需要手术切取获得, 因此该方法更适用于对经无创或微创检查手段无法确诊颈部淋巴结结核而需要行颈部淋巴结切取活检的患者;颈部淋巴结细胞悬液标本无法如外周血标本那样批量采集、集中处理,其操作程序也较复杂,检测价格较高,在低收入结核高负担地区推广有一定难度。另外,因本研究样本量所限,相关结论还需进行大样本量的研究来做进一步验证。

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(本文编辑:薛爱华)

Preliminary report on the value of cervical lymph node cells suspensions performed with interferon-gamma release assay for diagnosing tuberculous lymphadenitis

XUHui,YANGuang-peng,MAJing,XIAZhi-gang,TANGHui,LIJun.

DivisionofOralandMaxillofacialSurgery,People’sHospitalofXinjiangUyghurAutonomousRegion,Urumqi830001,China

XUHui,Email:omsxuhui@139.com

Objective The aim of the study was to evaluate the value of cervical lymph node cells suspensions performed with interferon-gamma release assays (IGRA) for diagnosing cervical tuberculous lymphadenitis (CTL). Methods Of the 48 patients with cervical lymphadenitis, 21 were confirmed as CTL, and 27 were diagnosed as non-CTL. IGRA using peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and cervical lymph node cell suspensions were performed to examine the IFN-γ response to the ESAT-6 and CFP-10 antigens. Spot forming cells (SFCs) in diffe-rent groups were compared using the Mann-WhitneyUtest. Categorical variables were compared using the Pearson Chi-squared test. The criterion for statistical significance wasP<0.05. Results The IGRA sensitivity of Cervical lymph node cell suspensions and PBMC was 90.48% (19/21) and 95.24% (20/21),respectively.The specificity of cervical lymph node cell suspensions and PBMC was 70.37% (19/27) and 92.59% (25/27),respectively.There was no significant difference of between sensitivity peripheral blood mononuclear cells and cervical lymph node cell suspensions (χ2=0.00,P>0.05).The specificity of cervical lymph node cell suspensions IGRA was significantly higher than that of peripheral blood mononuclear cells (χ2=4.43,P<0.05). In CTL group, SFCs median of PBMC and cervical lymph node cell suspensions performed IGRA were 109 (52,186) and 68 (30,156), respectively. There was no statistical difference in the SFCs median of PBMC and cervical lymph node cell suspensions (U=175.00,P>0.05). In non-CTL group, SFCs median of PBMC and cervical lymph node cell suspensions performed IGRA were 0 (0, 18) and 0 (0,3),respectively. There was no statistical difference in the SFCs median of PBMC and cervical lymph node cell suspensions. However, the SFCs of cervical lymph node cell suspensions in CTL group was significantly higher than that in non-CTL group (U=45.00,P<0.05). Conclusion Cervical lymph node cells suspensions performed with IGRA can be used as a tool to detect cervical tuberculous lymphadenitis.

Tuberculosis, lymph node; Specimen handling; Enzyme-linked immunospot assay; Interferon-gamma; Sensitivity and specificity

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.011

新疆维吾尔自治区人民医院科研基金 (20150118),国家自然基金 (81160210)

830001 乌鲁木齐,新疆维吾尔自治区人民医院口腔颌面外科(许辉、闫广鹏、李军),检验科(马晶、夏志刚、唐晖)

许辉, Email: omsxuhui@139.com

2017-05-31)

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