结核分枝杆菌三种蛋白在结核病血清学诊断中的评价研究

刘毅 张旭霞 张雨晴 李传友



·论著·

结核分枝杆菌三种蛋白在结核病血清学诊断中的评价研究

刘毅 张旭霞 张雨晴 李传友

目的 对结核分枝杆菌相对分子质量为38 000(以下采用38 kD表示)、线粒体通透性转换蛋白64 (mitochondrial permeability transition 64，MPT-64)和肝素结合血凝素(heparin-binding haemagglutinin，HBHA)蛋白在外周血中抗体的表达水平进行检测和比较，并对它们在结核病血清学方面的诊断价值进行评估。方法 选取2012年7月至2013年10月北京胸科医院收治的肺结核患者作为活动性肺结核(ATB)组，共78例；选取同期36例潜伏结核感染(LTBI)患者作为LTBI组；同期在北京胸科医院进行体检的31名健康人群(HC)作为HC组。将本实验室前期纯化的38 kD、MPT64和HBHA作为抗原应用于免疫学的检测，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清中三种蛋白抗体的表达水平，经过统计学处理后，分别比较ATB、LTBI和HC三组之间的差异，并结合受试者工作特征曲线计算各蛋白抗原的敏感度和特异度，评价三种蛋白血清抗体的临床诊断价值。结果 ELISA检测ATB组38 kD蛋白抗体的吸光度(A)450 nm处的A值(0.343±0.120)高于LTBI组(0.221±0.102)和HC组(0.143±0.097)，差异有统计学意义(t=3.07，P<0.05)； MPT64抗体的A450值(0.234±0.102)高于LTBI组(0.198±0.087)和HC组(0.123±0.075)，差异有统计学意义(t=3.79,P<0.05)；HBHA抗体的A450值(0.263±0.113)高于LTBI组(0.188±0.091)和HC组(0.148±0.078)，差异有统计学意义(t=2.70,P<0.05)。以38 kD、MPT64和HBHA蛋白抗体表达水平从LTBI组鉴别ATB组时的受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)分别为0.78、0.61和0.62，敏感度分别为71.79%、62.82%和52. 56%，特异度为72.22%、58.33%和69.44%；从HC组鉴别ATB组时的AUC分别为0.91、0.81和0.79，敏感度分别为87.17%、69.23%和73.08%，特异度为80.65%、74.19%和74.19%；从HC组鉴别LTBI组AUC分别为0.63、0.75和0.69，敏感度分别为58.33%、77.78%和63.89%，特异度为64.52%、51.61%和74.19%。结论 MTB 38 kD、MPT64和HBHA蛋白都有较好的免疫反应性，3种蛋白抗体在不同患者人群血清中的表达水平有差异，对肺结核诊断价值的评估结果表明采用ELISA对外周血中MTB蛋白抗体进行检测可作为结核病临床检测诊断的辅助方法。

分枝杆菌，结核； 细菌蛋白质类； 酶联免疫吸附测定； 抗体； 血清学试验； 评价研究

结核分枝杆菌(MTB)基因组共编码约4000多种蛋白[1]，这其中有很多蛋白显示了较好的免疫原性和应用价值。这些蛋白包括MTB 相对分子质量为38 000(以下采用38 kD表示)蛋白, 线粒体通透性转换蛋白64 (mitochondrial permeability transition 64, MPT-64)和肝素结合血凝素(heparin-binding Haemagglutinin, HBHA)蛋白等。这三种蛋白可在结核病患者的感染和发病过程中诱发免疫反应，对其临床诊断价值的研究成为人们关注的焦点。

MTB 38 kD蛋白是一种与磷酸盐转运有关的脂蛋白，含有特异的B 淋巴细胞和T淋巴细胞抗原决定簇，能诱导早期反应[2]。研究发现MTB的主要免疫原38 kD蛋白抗原免疫学活性很强，是较理想的血清学快速诊断抗原[3]。MPT64是MTB生长最早分泌的主要蛋白[4]，仅在MTB及牛分枝杆菌中存在，而作为疫苗的BCG中则不表达。MPT64蛋白能刺激T淋巴细胞反应，特异性也较好，可作为血清学诊断试剂[5]。HBHA是MTB分泌的一种黏附素，是一种糖蛋白，能介导肺结核和肺外结核的发生。有研究发现，HBHA诱导产生的γ-干扰素(interferon-γ，IFN-γ)可作为潜伏结核感染的诊断工具，有很好的敏感度和特异度[6]。

另外，MTB的潜伏感染和持留存在是导致结核病化疗疗程偏长、疗效不佳及化疗后易再次复发的主要原因之一[7],也是近年来肺结核卷土重来的重要原因之一[8]。而且对于潜伏结核感染 (latent tuberculosis infection, LTBI)的诊断存在严重不足，如何快速区分活动性肺结核(active tuberculosis, ATB)和LTBI是一直存在的难题[9]，寻找能够快速检测和诊断结核病的方法和手段一直是广大研究人员努力的方向[10]。

鉴于MPT64、38 kD和HBHA这3种蛋白的功能和自身的免疫原性，本研究通过对78例ATB、36例LTBI和31名健康对照(healthy control, HC)人群中3种蛋白的抗体表达水平的比较，分析在外周血中3种蛋白抗体的表达水平是否存在差异，进而评价3种蛋白对ATB和LTBI的诊断效能，探讨这3种蛋白在结核病血清学诊断中的应用价值, 为寻找更精确、更快速的免疫学检测方法提供线索，同时为研究MTB的持留存在奠定基础。

材料和方法

一、研究对象

选取2012年7月至2013年10月北京胸科医院收治的78例初治活动性肺结核患者作为ATB组；36例LTBI患者作为LTBI组；HC健康体检者31名作为HC组。所有研究对象均知情同意，经过首都医科大学附属北京胸科医院伦理委员会的评审认证。对三组对象的性别进行卡方检验，年龄进行方差分析，提示差异均无统计学意义，说明各组在年龄、性别等方面均具有可比性(表1)。

二、 分组标准

ATB组：按照病史、临床诊断、体征、胸部X线摄影和病原学诊断的结果，初次诊断为活动性肺结核患者，并排除结核性胸膜炎、结核性脑膜炎、体表结核和骨关节结核等其他部位的结核病。 LTBI组：有结核病患者接触史，无结核病临床症状，胸部X线摄影等检查无异常，询问BCG接种史并查验卡痕，排除BCG接种；进行PPD皮肤试验，72 h内硬结的平均直径≥10 mm，酶联免疫斑点试验(ELISPOT) 检测阳性，病原学检查阴性。HC组：无结核病临床症状，胸部X线摄影等检查无异常，询问BCG接种史，排除BCG接种；进行PPD皮肤试验，72 h内硬结的平均直径<5 mm 或ELISPOT 检测阴性。所有研究对象均排除HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等病毒感染，排除其他疾病如糖尿病、类风湿性关节炎、肾炎及系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病。

表1 本研究三组人群的一般资料

三、 试验试剂与仪器

酶联免疫吸附实验(ELISA)检测试剂盒(美国BD公司)，山羊抗人IgG(北京中杉金桥生物公司)，多功能酶标仪(美国BioTek公司)，恒温摇床(江苏太仓仪器)，离心机(德国Sigma公司)。

四、蛋白抗原

实验室前期构建了原核表达载体，在大肠埃希菌中诱导后大量表达蛋白，经过纯化后分离获得本研究中所需的蛋白，详细步骤可参考文献[11]。

五、ELISA方法检测血清中的抗体

用蛋白抗原包被ELISA酶标板，用3%牛血清白蛋白/磷酸盐缓冲液(BSA/PBS)封闭(200 μl/孔)；向包被好的ELISA酶标板加入试剂稀释液(作为空白对照)、稀释后血清(100 μl/孔)，37 ℃孵育1 h。向酶标板加入1∶2000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG，37 ℃温箱孵育1.5 h，用吐温磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤3次。加入底物试剂底物A(H2O2)+底物B[四甲基联苯胺(TMB)](100 μl/孔)，室温放置，观察反应的颜色变化，待反应明显时加入反应终止液(2 mol/L硫酸)。反应终止后30 min内，测吸光度(A)450 nm处的A值。

六、统计学处理

根据血清抗体浓度A450 nm吸光度值，用GraphPad Prism 5软件绘散点图；采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。多组间比较采用非参数独立样本的Kruskal-Wallis单因素ANOVA检验，任意两组独立变量之间的比较用配对t检验的方法, 计量资料采用百分率与构成比表示，组间差异的比较采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

七、评价诊断效能

为评价3种蛋白分别对ATB和LTBI的诊断效能，而且对LTBI的诊断必须能同时与ATB和HC组鉴别开，因此将鉴别诊断分析设计为3组：从LTBI组鉴别ATB组时以LTBI组为对照，从HC组鉴别LTBI组时以HC组为对照，从HC组鉴别ATB组时以HC组为对照。以SPSS 21.0软件分别绘制3种蛋白抗原对上述3组人群进行鉴别诊断的受试者工作特征(ROC)曲线，计算曲线下面积(AUC), 用ROC曲线来描述对该蛋白抗原检测的敏感度和特异度之间的关系，最佳临界值(cut-off)的选取方法是根据SPSS提供的曲线上各种可能的cut-off点的敏感度和特异度，计算Youden指数(灵敏感度+特异度-1)最大时对应的A值则为最佳cut-off值；采用该cut-off值判定实验组血清和对照组血清中的和阴性和阳性比例，待测标本A值≥该值判为阳性，待测标本A值<该值判为阴性。敏感度=实验组中的阳性结果数量/总的样本数量×100%；特异度=对照组中的阴性结果数量/总的样本数量×100%。

结 果

一、三组人群血清中38 kD蛋白抗体水平分布

根据各组血清ELISA检测结果，在A450 mm处的A值分布做出散点图(图1)。图1显示：ATB组(A值为0.343±0.120)和LTBI组(A值为0.221±0.102)相比，A值差异有统计学意义(t=3.07,P<0.05)；ATB组(A值为0.343±0.120)和HC组(A值为0.143±0.097)相比，A值差异有统计学意义 (t=2.70,P<0.01)；而在LTBI组(A值为0.221±0.102)和HC组(A值为0.143±0.097)间血清样本抗体检测的A值分布相近，差异无统计学意义(t=3.30,P>0.05)。

ATB:活动性肺结核患者组；LTBI:潜伏结核感染组；HC：健康人群组。图中横线代表中位数的水平图1 血清中相对分子质量38 000蛋白抗体水平检测分布散点图

二、三组人群血清中MPT64蛋白抗体水平分布

根据各组血清ELISA检测结果，在A450 mm处的A值分布做出散点图(图2)。图2显示：ATB组(A值为0.234±0.102)和LTBI组(A值为0.198±0.087)相比，A值差异有统计学意义(t=3.79,P<0.05)；ATB组(A值为0.234±0.102)和HC组(A值为0.123±0.075)相比，A值差异有统计学意义(t=3.14，P<0.01)；而在LTBI组(A值为0.198±0.087)和HC组(A值为0.123±0.075)间血清样本抗体检测的A值分布不同，差异有统计学意义(t=4.29，P<0.05)。

ATB:活动性肺结核患者组；LTBI:潜伏结核感染组；HC：健康人群组。图中横线代表中位数的水平图2 血清中MPT64蛋白抗体水平检测分布散点图

三、三组人群血清中HBHA蛋白抗体水平分布

根据各组血清ELISA检测结果，在A450 mm处的A值分布做出散点图(图3)。图3显示：ATB组(A值为0.263±0.113)和LTBI组(A值为0.188±0.091)相比，A值差异有统计学意义(t=2.70,P<0.05)；ATB组(A值为0.263±0.113)和HC组(A值为0.148±0.078)相比，A值差异有统计学意义(t=1.98,P<0.01), 而在LTBI组(A值为0.188±0.091)和HC组(A值为0.148±0.078)间血清样本抗体检测的A值分布相近，差异无统计学意义(t=3.69，P>0.05)。

ATB:活动性肺结核患者组；LTBI:潜伏结核感染组；HC：健康人群组。图中横线代表中位数的水平图3 血清中HBHA蛋白抗体水平检测分布散点图

四、各组血清中38 kD、MPT64和HBHA蛋白抗体水平检测的敏感度、特异度比较

由表2可见， ATB和LTBI 2个组比较，以LTBI组为对照，通过38 kD蛋白抗体浓度检测，诊断活动性肺结核的敏感度为71.79%，特异度为72.22%；MPT64的敏感度为62.82%，特异度为58.33%；HBHA的敏感度为52.56%，特异度为69.44%；3种蛋白抗体检测ROC的(AUC)分别为0.78、0.61和0.62。

由表3可见， LTBI组和HC组比较，以HC组为对照，抗原38 kD蛋白抗体浓度检测LTBI的敏感度为58.33%，特异度为64.52%；MPT64的敏感度为77.78%，特异度为51.61%；HBHA的敏感度为63.89%，特异度为74.19%；3种蛋白抗体检测的AUC面积分别为0.63、0.75和0.69。

表2 不同蛋白抗原在ATB组和LTBI组中的敏感度和特异度比较

注 AUC：ROC曲线下面积；敏感度(%)=ATB组中的阳性结果数量/总的样本数量×100%, 特异度(%)=LTBI组中的阴性结果数量/总的样本数量×100%

表3 不同蛋白抗原在LTBI组和HC组中的敏感度和特异度比较

注 AUC：ROC曲线下面积；敏感度(%)=LTBI组中的阳性结果数量/总的样本数量×100%, 特异度(%)=HC组中的阴性结果数量/总的样本数量×100%

表4 不同蛋白抗原在ATB组和HC组中的敏感度和特异度比较

注 AUC：ROC曲线下面积；敏感度(%)=ATB组中的阳性结果数量/总的样本数量×100%； 特异度(%)=HC组中的阴性结果数量/总的样本数量×100%

由表4可见，LTBI组和HC组比较，以HC组为对照，抗原38 kD蛋白抗体浓度检测LTBI的敏感度为87.17%，特异度为80.65%；MPT64的敏感度为69.23%，特异度为74.19%；HBHA的敏感度为73.08%，特异度为74.19%；3种蛋白抗体检测的AUC面积分别为0.91、0.81和0.79。

讨 论

结核病是危害人类健康的重要疾病，MTB可在人体内长期处于持续感染状态，形成潜伏结核感染，这已成为目前在全世界范围内检测和消灭结核病的最大阻碍之一。正确快速地检测结核病，对结核病的控制和治疗都具有重要的意义。目前的检测疗法虽有很多种，但是仍然缺乏有效和快速的检测方法。免疫学检测方法是临床实验室诊断的重要补充，主要包括ELISA方法检测MTB抗体[12]和ELISPOT方法检测细胞免疫反应[13]。笔者通过将表达纯化的蛋白应用于免疫学检测，分析ATB、LTBI和HC这3组人群之间血清蛋白抗体表达的差异，寻找可应用于临床诊断分析的方法和策略。

本研究结果表明38 kD蛋白血清抗体检测在鉴别ATB和LTBI时具有较好的敏感度和特异度，而HBHA蛋白血清抗体检测显示了较好的特异度但敏感度较差，38 kD蛋白显示了更好的总体诊断效能(AUC=0.78)，只是本研究3种蛋白血清抗体检测的敏感度和特异度都有待提高。MPT64蛋白血清抗体检测显示，在鉴别LTBI和HC组时具有较好的敏感度但特异度较差，而38 kD和HBHA蛋白血清抗体检测敏感度均偏低(表3)，MPT64蛋白的蛋白血清抗体检测在区分LTBI和HC组显示了较好的总体诊断效能(AUC=0.75)。而在区分ATB组和HC组的研究中，3种蛋白血清抗体检测均显示了较好的诊断效能，尤以38 kD蛋白血清抗体检测显示了更好的诊断效能(AUC=0.91)，敏感度和特异度分别达到87.17%和80.65%，MPT64和HBHA蛋白的蛋白血清抗体检测的敏感度和特异度一般，说明38 kD蛋白的蛋白血清抗体检测在诊断活动性肺结核上具有较好的临床诊断和应用价值，这也和研究报道38 kD蛋白抗体在ATB患者血清中高表达的结果相一致[14]。可见，虽然在外周血中3种蛋白抗体表达水平在ATB和LTBI组比较时差异均有统计学意义，但应用到临床诊断时的敏感度和特异度却产生了很大的差异，在区分LTBI和HC组时也遇到同样的问题，这说明不能只看总体的表达水平差异是否存在统计学意义，而应该详细评估它们在不同肺结核感染状态下的诊断价值。研究结果也说明，这3种蛋白在结核感染和发病中具有不同的临床和诊断价值。

导致敏感度和特异度变化的原因有很多，其中一个原因可能是患者血清中抗体的表达水平不够高，不足以将ATB和LTBI分开，可能需要再另外补加新的检测抗原[15]，或者改变检测方法和检测对象[16]。已有研究表明将多个蛋白并联分析，或者进行抗原的不同组合，会使敏感度和特异度都得到加强[17]；有的研究甚至融合了7种蛋白抗原，结果显示了很好的敏感度和特异度[18]。未来可以通过将这3种抗原进行组合检测和并联分析，通过不同抗原进行组合分析提高诊断的敏感度和特异度，可以进一步提高蛋白抗原在血清学中的诊断和应用价值。

本研究在收集标本时虽然缺少非结核呼吸系统疾病对照，在实验设计上有不够完善之处，未能将非结核呼吸疾病完全排除，但因为该研究中选取的蛋白均为结核分枝杆菌中特异表达的分泌蛋白，只在分枝杆菌属中表达[19-20]，在其他的细菌或者病毒中均没有表达或者同源性很低，因此对血清学检测特异性的影响不会很大，所以本研究仍然具有重要的价值和意义。笔者在后续的研究中将会增加非结核呼吸系统疾病作为对照，更好地满足研究的特异性要求。其次，在研究设计之初，BCG接种组被排除，是担心会影响真正的LTBI组的研究。有研究表明BCG的接种会影响机体的免疫应答状况[21]，接种后的免疫状态可能和LTBI非常相似，这也会对检测结果造成影响，因此将BCG接种过的健康对照者排除。当然，最好的设计是健康对照中将BCG接种的人群单独作为一组进行研究，笔者在以后的研究中将会注意这方面的设计和要求，从而更好地体现BCG接种对血清学和免疫学检测的影响情况。

综上所述，本研究通过检测分析3种蛋白的免疫原性和在血清中抗体的表达水平，验证了3种蛋白对于肺结核的检测和分析能力，可作为临床结核病诊断的重要补充，有较好的临床应用价值。

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(本文编辑：王然 李敬文)

The evaluation study of threeMycobacteriumtuberculosisproteins in tuberculosis serologic diagnosis

LIUYi,ZHANGXu-xia,ZHANGYu-qing,LIChuan-you.

DepartmentofBacteriologyandImmunology,BeijingKeyLaboratoryonDrug-ResistantTuberculosisResearch,BeijingTuberculosisandThoracicTumorResearchInstitute;BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China

LIChuan-you,Email:lichuanyou6688@hotmail.com

Objective To compare the antibody expression of three recombinationMycobacteriumtuberculosis(MTB) protein antigens (MTB relative molecular mass 38 000 short as 38 kD, MPT64 and HBHA)in the peripheral blood serum, and comprehensively assess their performances in serologic diagnosis of tuberculosis (TB). Methods Seventy eight active tuberculosis (ATB) cases and 36 latent tuberculosis infection (LTBI) cases were selected from Beijing Chest Hospital as case groups, during July 2012 to October 2013. And 31 healthy control (HC) cases were recruited from the TB physical examination in Beijing Chest Hospital at the same period. We used these purified protein generated by our laboratory as antigens to measure the expression level of antibodies in serum by ELSIA, then compared the difference between ATB, LTBI and HC by statistical method. Sensitivity, specificity and diagnostic efficiency were calculated after getting the receiver operating characteristic (ROC) curve analysis with the results of Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, comprehensive diagnosis performance and application values of these proteins were evaluated. Results The absorbance (A)450 nmvalue of 38 kD measured by ELISA was higher in ATB group (0.343±0.120) than those in LTBI group (0.221±0.102) and HC group (0.143±0.097). The difference showed statistically significance (t=3.07,P<0.05). TheAvalue of MPT64 measured by ELISA was higher in ATB group (0.234±0.102) than those in LTBI group (0.198±0.087) and HC group (0.123±0.075). The difference showed statistically significance (t=3.79,P<0.05). TheAvalue of HBHA measured by ELISA was higher in ATB group (0.263±0.113) than those in LTBI group (0.188±0.091) and HC group (0.148±0.078). The difference showed statistically significance (t=2.70,P<0.05). Areas under the curve (AUC) of 38 KD, MPT64 and HBHA antibodies which used to distinguish ATB and LTBI were 0.78, 0.61 and 0.62; the sensitivity were 71.79%, 62.82% and 52. 56% separately; and the specificity were 72.22%, 58.33% and 69.44% separately. AUC which used to distinguish ATB and HC were 0.91, 0.81 and 0.79; the sensitivity were 87.17%, 69.23% and 73.08% separately; and the specificity were 80.65%, 74.19% and 74.19% separately. AUC which used for distinguish LTBI and HC were 0.63, 0.75 and 0.69; the sensitivity were 58.33%, 77.78% and 63.89% separately; the specificity were 64.52%, 51.61% and 74.19% separately. Conclusion The three proteins possessed good immune-reactivity characteristics, and the expression level of their antibodies showed significantly difference in different patient groups. The assessment of diagnostic efficiency for TB indicated that through detecting antibodies expression levels in peripheral blood of TB patient based on ELISA is an assistant method for diagnosis of TB in clinical laboratory.

Mycobacteriumtuberculosis; Bacterial proteins; Enzyme-linked immunosorbent assay; Antibodies; Serologic tests； Evaluation studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.006

首都卫生发展科研专项(2014-4-2163)；北京市医院管理局青苗计划(QML20161601)

101149 北京市结核病胸部肿瘤研究所 首都医科大学附属北京胸科医院 耐药结核病重点实验室细菌免疫室

李传友，Email：lichuanyou6688@hotmail.com

2017-05-15)