成骨不全环状RNA生物信息学分析

马翔 鲁艳芹 王延宙 刘军龙 苏学利 张遥 左清利 任秀智 韩金祥*

1. 济南大学-山东省医学科学院医学与生命科学学院，山东 济南 250022 2. 山东省医药生物技术研究中心，山东省医学科学院，山东 济南 250062 3. 山东省立医院，山东 济南 250021 4. 天津市武清区人民医院，天津 301700

环状RNA作为新型的非编码RNA分子稳定性高，存在范围广泛，具有高表达性、组织特异性以及良好的物种保守性。CircRNAs具有重要的调控功能，能作为miRNAs海绵功能分子[1]。在斑马鱼实验中，胚胎中超高表达CDR1as 可导致斑马鱼脑中脑体积减少，将人/鼠的CDR1as注射到斑马鱼中会出现与miR-7敲除相似的表型，CDR1as的表达水平与miR-7靶基因表达水平表现出一致性，表明CDR1as是miR-7的环状抑制剂[2-3]。研究发现circRNAs与阿兹海默症、动脉粥样硬化、糖尿病、癌症等疾病的发生有关[4-8]。最新研究发现在一些癌症(肺癌、胃癌)等疾病中对于筛选出差异性表达的circRNAs，通过结合临床信息以及医学统计学检验，认为所筛选出的circRNAs具有作为疾病诊断潜在标记物的可能性[9-11]。同时又有研究发现相比于其他组织血液中很多circRNAs分子表达稳定性更高[12]，circRNAs所发挥的生物学功能和作为疾病诊断标志物在临床治疗上的潜力是巨大的。

成骨不全(osteogenesisImperfecta，OI)是一种通过遗传或者基因突变而产生的先天性骨骼发育障碍结蹄组织疾病[13-15]。通过对116种相关的miRNAs进行检测发现 miR-21与miR-26a等11 种miRNAs在成骨不全血清中存在差异表达[16-18]。本文拟通过生物信息学预测，分析与成骨不全差异性表达miRNAs相互作用的circRNAs，同时探讨circRNA-miRNA-靶基因之间的相互作用。

1 材料和方法

1.1 miRNAs-circRNAs相互作用的生物信息学预测与网络分析

采用starbase软件(http://starbase.sysu.edu.cn/)[19]分别对成骨不全血清中差异表达的miR-21、miR-26a、miR-29a、miR-29b、miR-30e、miR-34c、miR-133a、miR-145、miR-210、miR-489与miR-1297等 11 种miRNAs进行生物信息学预测。采用Cytoscape 3.2.1(www.cytoscape.org)对在成骨不全血清中差异表达的上述11 种miRNAs通过starbase预测的141种circRNAs进行网络分析[20]。参数设置：其中将circRNAs用圆形表示，miRNAs用正方形表示，节点的大小(圆的大小)代表该分子在网络中的度(所对应的miRNAs邻居个数)，颜色随节点大小(圆的大小)由浅绿到深红渐变。

1.2 miRNAs靶基因的生物信息学预测与网络分析

通过miRWalk软件(http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk)[21]对上述在成骨不全血清中差异表达的11 种miRNAs利用DIANA-mT、miRanda、miRDB、miRWalk、RNAhybrid、PICTAR4、PICTAR5、PITA、RNA22与TargetScan十个数据库进行靶基因的生物信息学预测。对原始数据首先进五个数据库以上记录的相互作用靶基因分析。将得到的靶基因采用Cytoscape 3.2.1[19](www.cytoscape.org)进行网络分析。对预测的靶基因通过DAVID软件(www.david.ncifcrf.gov)进行pathway分析[22]。

2 结果

2.1 miRNAs-circRNAs相互作用的生物信息学预测与网络分析

Starbase软件对11种不同miRNAs所预测的靶circRNAs的总数量为222个，其中非重叠circRNAs为141个。

对预测出的circRNAs进一步分析得出CPNE1_hsa_circ_000657与miR-26a、miR-34c、miR-30e和miR-1297等4种miRNAs相互作用；KIAA1586_hsa_circ_001439 与miR-29、amiR-29b、miR-34c和miR-133a等4种miRNAs相互作用；CYP4F3_hsa_circ_001395与miR-29a、miR-29b、miR-30e和miR-133a等4种miRNA相互作用；MIB1_hsa_circ_002013和MIB1_hsa_circ_000886与miR-29a、miR-29b、miR-34c和miR-145等4种miRNA相互作用。见图1。14种circRNAs分别与3种不同的miRNAs共同相互作用。见表1、图1。

2.2 miRNAs靶基因的生物信息学预测与网络分析

MiRwalk对11种miRNAs靶基因预测结果中，对超过7个数据库以上的三种情况进行分析。分析得到超过7个数据库记录的靶基因总数为1297个，非重叠靶基因944个。超过8个数据库记录的靶基因总数为416个，非重叠靶基因312个。超过9个数据库记录的靶基因总数为91个，非重叠靶基因70个。

Cytoscape网络分析结果表明7个以上数据库记录的MiRNA-Taget Gene相互作用中CNOT6节点最大，其次ABCE1，BCL11A，ELF2，EML5，NAV3，JARID2，KLF4，QKI这8个靶基因节点较大。8个以上数据库记录的MiRNA-Taget Gene相互作用中ELF2与 NAV3基因节点最大分别与4个miRNA相互作用，PTEN、TET1、KBTBD8、TRIB2、RLF、REV3L、SBF2、PAN3、RARB 9个靶基因节点较大分别与3种不同miRNA相互作用。9个以上数据库记录的MiRNA-Taget Gene相互作用中仅NAV3基因节点最大与3个不同miRNA相互作用，ADAMTS6、ANKRD13C、C5orf13、COL11A1等19个靶基因节点较大分别与2种miRNA相互作用。

目前为止有文献纪录与骨病相关的信号通主要包括WNT、OPG/RNAKL/RNAK、TGF-beta、MAPK、NOTCH信号通路等途径[23-24]。将超过7个数据库与9个数据库预测所共有的信号通路为Focal adhesion、ECM-receptor interaction、TGF-beta signaling pathway、Notch signaling pathway、Tight junction、Axon guidance、Pathways in cancer、Wnt signaling pathway、Small cell lung cancer、mTOR signaling pathway。见表1。

表1 成骨不全差异性miRNAs靶基因的KEGG信号通路在7-9以上预测数据库中的P值变化Table 1 P value in KEGG signaling pathways of involved genes predicted by more than 7-9 databases targeting differentially expressed miRNAs of OI

对以上除肿瘤相关信号通路外其余信号通路得到的靶基因进行circRNA-miRNA-Target Gene分析表明，YES1基因与miR-133a、miR-145以及FAT1_hsa_circ_000713与LMNB2_hsa_circ_001499之间存在相互作用。PPP2CA与miR-29a、miR-29b、miR-133a以及KIAA1586_hsa_circ_001439之间存在相互作用。NTN4和SRGAP1与miR-26a、miR-145以及RFC1_hsa_circ_001649之间存在相互作用。见图2。

图2 成骨不全差异性miRNAs及其相互作用的circRNAs与靶基因的网络分析Fig.2 Network analysis of the interaction among differentially expressed miRNAs of OI and predicted circRNAs and genes

图3 成骨不全差异性miRNAs与其靶基因间相互作用网络分析图Fig.3 Network analysis between differentially expressed miRNAs of OI and predicted target genes

3 讨论

本文分析预测出的4种差异性表达成骨不全miRNA所共有的MIB1_hsa_circ_000886等5种circRNA以及3种差异性成骨不全miRNA所共有的19种circRNA在成骨不全中的生物学作用仍需进一步实验探究。同时所预测得到的相关circRNAs能否作为成骨不全血清中差异表达的11种miRNA的海绵功能需进一步实验探究。通过对成骨不全血清中差异表达的11种miRNAs进行circRNAs及其靶基因的预测得到在Tight junction信号通路中 YES1基因与miR-133a、miR-145以及FAT1_hsa_circ_000713与LMNB2_hsa_circ_001499之间存在相互作用，TGF-beta，WNT以及Tight junction信号通路中PPP2CA与miR-29a、miR-29b、miR-133a以及KIAA1586_hsa_circ_001439之间存在相互作用，Axon guidance 信号通路中NTN4和SRGAP1与miR-26a、miR-145以及RFC1_hsa_circ_001649之间存在相互作用，这些相互作用的circRNA-miRNA-靶基因是否在成骨不全疾病中发挥着海绵功能需进一步实验探究。

YES1是一种致癌基因，与ATP结合，酶联反应，蛋白连接，表皮生长因子受体连接，离子通道绑定，受体结合等有关[25-26]。PP2A是一种丝/苏氨酸磷蛋白磷酸酶，是一种多功能性蛋白酶，与细胞分裂周期和信号传导相关。PP2A的催化亚基PP2Ac包括两种亚型PP2CA和PP2CB，其在胚胎发育和阿兹海默症和肿瘤等疾病中发挥着重要作用[27-29]。NTN4是一种蛋白编码基因，发挥着laminin-1连接和蛋白连接的功能[30-31]。SRGAP1同样也是蛋白编码基因，发挥着GTPase激活功能，连接RacGTPase以及蛋白连接功能[32]。

骨的形成是通过成骨细胞合成骨基质，分泌骨基质，矿化骨基质而来。而成骨细胞来源于多潜能的间充质干细胞，多潜能的间充质干细胞存在于脂肪和骨髓中，其在两种不同组织间的分化机制与多种生长因子和胞外信号通路相关，包括Wnt信号通路，OPG/RANKL/RANK、TGF-beta、MAPK、NOTCH、BMP信号通路，hedgehogs信号通路等[33-37]。Wnt信号通路中相关分子在骨髓间充质干细胞分化为成熟成骨细胞，成骨细胞的增殖以及功能上发挥着重要的调节功能，这些信号通路中的相关分子与细胞内钙离子水平，骨密度，骨量密切联系[37]。紧密连接(Tight junction，TJ)在细胞旁途径中发挥着重要作用，同时参与调解细胞通透性，该信号通路与很多生理，病理等发生密切相关[38]。轴突导向(Axon guidance)是神经系统发育过程的一个分支[39]。TGF-beta 信号通路在胚胎发生，成骨细胞的分化与增殖，和软骨损伤后的修复中发挥着重要的作用，同时影响多种组织的修复再生[34]。

小脑变性相关蛋白1的天然环状反义转录物(antisense to the cerebellar degeneration-related protein1 transcript， CDR1as)中含有70个左右miRNA-7的结合位点，并且与相应的miRNA所作用的靶基因在表达水平上表现出一致性，作为miRNA的环状抑制剂发挥着miRNA海绵功能，Y染色体性别决定区(sex-determining region Y，SRY)中含有16个miR-138的结合位点，同样发挥着miRNA海绵功能[2-3]。通过对成骨不全血清中差异表达的11种miRNAs进行circRNAs及其靶基因的预测分析得到上述结果，所预测得到的相关circRNA-miRNA-靶基因中相关circRNA是否作为miRNA海绵功能影响相应靶基因表达进而在成骨不全疾病的发生以及发展中发挥着重要作用仍需进一步的实验研究。