高通量测序法研究不同pH的饮用水对SPF小鼠肠道微生物的影响

余 强，刘月环，王志远，吴旧生

(1.浙江大学动物科学学院，杭州 310058； 2.浙江省医学科学院，杭州 310013)

高通量测序法研究不同pH的饮用水对SPF小鼠肠道微生物的影响

余 强1,2#，刘月环2#，王志远2，吴旧生1*

(1.浙江大学动物科学学院，杭州 310058； 2.浙江省医学科学院，杭州 310013)

目的 研究不同pH饮用水对SPF小鼠肠道微生物多样性的影响。方法 21日龄SPF小鼠90只随机分成3组，每组30只，分别给予三类水，即酸化水(pH 3.0)，中性水(pH 7.0)和碱性水(pH 9.0)，并进行为期三个月的饲养。每组分别在饲养4周、8周、12周末各处死10只动物，取血清按SPF国标项目检测了细菌、病毒、寄生虫，取回盲部内容物，根据细菌16S rRNA的保守性设计引物，构建文库，进行高通量(Illumina)测序，获得10 G的数据，并对数据进行统计，聚类分析。结果 以pH 3.0处理的小鼠肠道微生物丰富度适中，稳定性高。结论 在规模化饲养条件下，选取pH 3.0饮用水小鼠能较长时间维持肠道微生物多样性，稳定性达到一个平台。本研究为长期稳定维持动物质量的生产实践提供了理论与技术支持，也是胃肠道宏基因组学技术在动物质量控制领域的一个具体应用。

肠道微生物；16S rRNA；高通量测序；饮用水；小鼠

目前，大多数实验动物中心都采用动物饮用水作酸化处理的办法来解决清洁级以上实验动物的饮水问题[1]。有些单位将饮用水高压灭菌(121℃，25 ～ 30 min)后酸化至pH 2.5左右(pH 2.5 ～ 3.0)效果比较理想，也有一些单位使用碱化水(pH 9.0)长期饲养动物，效果也相对理想。最近有报道表明，动物肠道微生物对其实验结果有相对大的影响，许多科研结果不能重复也归咎于肠菌的影响[2]。16S rRNA是原核生物核糖体30S小亚基的组成部分，它包含10个保守区和9个高变区，其中保守区为细菌共有，而高变区则有种属特异性，其基因序列随着菌种间的亲缘关系不同而有一定差异。所以，高变区序列是能解释细菌物种间差异的特征核酸序列，可作为细菌系统发育和分类鉴定的指标。因此可按这一特征设计16S rDNA引物，并扩增、测序来鉴定样本中的微生物种类[3]。鉴于目前还没有酸化水对小鼠肠道微生物结构与稳定性的影响报道，本文利用16S rRNA高通量测序技术探讨了不同pH饮用水连续饲养三个月小鼠的肠道微生物稳定性和多样性，为今后动物质量控制打下基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物与回盲部肠内容物取样

实验小鼠由浙江省医学科学院实验动物中心提供【SCXK(浙)2014-0001】，实验在浙江省医学科学院实验动物中心进行【SYXK(浙)2014-0008】。选取21日龄SPF级ICR小鼠(雌、雄鼠兼用)90只，随机分成3组，每组30只，分别给予酸化水(pH 3.0)、中性水(pH 7.0)和碱性水(pH 9.0)，三类水进行为期三个月的饲养，每组分别在饲养4周、8周、12周末处死10只动物，取血按GB14922.2-2011进行检测，回盲部V形剪口，灭菌牙签挑取内容物。

1.2 肠菌基因组提取

1.2.1 DNA质量检测

用常规细菌提取试剂盒分别提取90个个体基因组，同组处理内物容混在一起组成样本池，进行16S rRNA建库，样本分别标号为I1、I4、I7、I10、I13、I16、I19、I22、I25。其中I1、I10、I19为同个pH 3.0值，I4、I13、I22为同个pH 7.0值，I7、I16、I25为同个pH 9.0值，I1、I4、I7为同个处理时间(饲养4周)，I10、I13、I16为同个处理时间(饲养8周)，I19、I22、I25为同个处理时间(饲养12周)。用1%琼脂糖电泳检测DNA样品有无杂质和降解；Nano Photometer分光光度计检测DNA样品的纯度；Qubit 2.0 Flurometer检测DNA样品的浓度。

1.2.2 16S rDNA文库制备

取10 ng的DNA模板，对目的区域进行扩增：根据测序区域的不同，选择对应区域的扩增引物：V3区引物为338F-533R，V3+V4区引物为314F-805R，V6区引物为967F-1046R；使用Takara的Ex Taq酶，确保扩增效率和准确性。继而对扩增出的目的片段进行富集，同时加入特异index序列。建库流程见图1。

图1 小鼠肠菌16S rDNA文库建立流程图Fig.1 A diagram of construction of the mouse intestinal bacteria 16S rDNA library

1.2.3 库检

库检流程：构建文库 → Qubit 2.0进行初步定量 → 稀释文库至1 ng/μL → Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后 → Bio-Rad CFX 96荧光定量PCR仪，Bio-Rad KIT iQ SYBR GRN进行QPCR，对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。

1.2.4 测序

检测合格的文库，采用Hiseq进行测序，测序策略为PE250。其实验流程如下：DNA提取 → 高变区扩增及产物纯化 → 目的片段富集及产物纯化 → 末端修复，加接头 → 文库库检 → 上机测序。

1.3 信息分析流程

测序所得序列应去除问题序列，如低质量碱基、接头污染序列等并完成数据过滤，得到目标序列用于分析。过滤后的序列称为Clean Reads。首先，将双端测序的相应的Read1(5’端测序所得序列片段)与Read2(3’端测序所得序列片段)利用序列拼接方法PEAR[4]进行拼接；然后，对拼接后的序列利用软件QIIME 1.8.0版本进行分析[5-7]，信息分析流程如下：原始下机序列 → 质控 → 序列拼接 → 参考库对比 → OTUs分析 → 多样性分析 → 聚类热图分析。

2 结果

2.1 回盲部肠菌原始序列数据

Illumina高通量测序结果最初以原始图像数据文件的存在，经CASAVA软件进行碱基识别(base calling)后，转为原始测序序列(raw data)，其结果以FASTQ(简称为fq)文件的形式存储。FASTQ文件信息的内容包含了所测序列的名称、碱基序列及相对应的测序质量信息。在FASTQ格式文件中，每个碱基对应一个碱基质量字符，每个碱基质量字符对应的ASCII码值减去33(Sanger质量值体系)，即为该碱基的测序质量得分。

2.2 数据统计与质控

首先去除接头污染(接头污染是指由于插入片段过短而导致部分read序列中含有测序引物序列，对于双端测序，若一端受到接头污染，则去掉两端的reads)；然后去除低质量的reads(reads中质量值Q ≤ 19的碱基占总碱基的30%以上，对于双端测序，若一端为低质量reads，则会去掉两端reads)；最后去除含N比例大于5%的reads(对于双端测序，若一端含N比例大于5%，则会去掉两端reads)。Q值是Phred Quality Score的简称；N碱基是指未知碱基。结果见表1。

2.3 序列拼接

对过滤后的序列，采用PEAR[4]序列拼接算法将双末端测序序列根据末尾的重叠情况合并成一条序列，再进行下一步分析。PEAR程序可以合并来自可变长度靶片段的原始Illumina双端reads。它通过统计检验来减少假阳性结果的数量。各个样本的拼接成功比例均大于98%(横坐标表示样本，纵坐标表示拼接成功序列占总数的百分比。结果见图2。

表1 数据过滤统计结果Tab.1 Results of data filtering statistics

注：(1)Raw Q30 Bases Rate (%)：Raw Reads中测序质量值大于30(错误率小于0.1%)的碱基占总碱基(Raw Reads)的比例。(2)Filter Q30 Bases Rate (%)：Filter Reads中测序质量值大于30(错误率小于0.1%)的碱基占总碱基(Filter Reads)的比例。

Note. (1) Raw Q30 B base rate (%): raw reads percentage of base (raw reads) with a base value greater than 30 (error rate less than 0.1%). (2) Filter Q30 base rate (%): filter read percentage of base (filter reads) with a mass value greater than 30 (error rate less than 0.1%).

2.4 OTUs分析

2.4.1 OTUs统计及分布

OTUs，即分类操作单元，它代表的是一类相似序列的集合，默认将序列相似度大于97%的Tags归为一类OTUs，认为它们具有相同的物种来源，从中选出代表序列可以简化数据集，以便进行下一步的分析，本实验得到的序列与参考数据库中的OTUs序列进行比对，挑选相似度大于97%的序列归为一类OTUs。物种的识别是根据数据库中各物种相应的识别序列与我们挑选的OTUs进行比对的结果。剔除所有样品中的序列数小于2条的OTUs。结果见表2。

表2 OTUs数目Tab.2 Number of OTUs

图2 序列拼接百分率(红色虚线表示拼接比例 为90%)Fig.2 Percentage of sequence splicing (red dotted line indicates 90% splicing ratio)

2.4.2 OTUs丰度排秩分析

OTUs丰度排秩(rank-abundance)是根据每个OTUs所含序列数的多少对OTUs进行排序，丰度排秩可以很直观的看出在每个样本里OTUs所包含的序列数的分布情况，曲线越平缓，OTUs分布越均匀，结果见图3。横坐标表示OTUs按包含的序列数目排秩，纵坐标表示该OTUs包含的序列数的相对丰度，每一条线表示对应一个样本的OTUs分布情况。结果表明样品OTUs丰度排秩从高到低依次为I19>I1>I4>I10>I22>I16>I25>I13>I7。

2.4.3 样品聚类树图

对所得各样品的物种分布数据，标准化之后，计算Bray-Curtis距离值[8]，利用层次聚类算法对各样品进行聚类。通过聚类分析我们可以直观的看出样品间的相似情况以及离群点的存在情况。Bray-Curtis距离计算公式如下：

其中，BCij表示样本i和j之间的Bray-Curtis距离，k表示两个样本共有的OTUs的个数，m、n分别表示两个样本所有的OTUs总数；Ck表示共有的包含较少序列的OTUs的序列数，Sim表示样本i中某个OTUs所包含的序列数，Sjn表示样本j中某个OTUs所包含的序列数。Bray-Curtis距离介于0 ～ 1之间，为0表示两个样本的物种组成完全一致，为1则表示两样本的物种组成完全不一致。通过计算此距离得到的样本聚类树见图4。(横坐标表示样本，纵坐标表示距离值，分支点处的纵坐标表示分支的类之间的距离，不同颜色表示不同分组)结果表明样品I4与I10的物种组成最相似。

图3 OTUs丰度排秩Fig.3 OTUs abundance rankings of the samples

2.5 进化树分析

根据已知的参考数据库中的亲缘关系，我们利用PyNAST序列比对算法[6]对得到的OTUs构建进化树，利用Graphlan[9]软件得到如下进化树，见图5。结果显示了每个样本不同阶段共有的菌群，不同颜色分别代表在整棵树里面比较重要的一些子树，包含序列越多圆圈越大。

2.6 Alpha多样性分析

Alpha多样性分析了样品内菌群的多样性情况，主要包括菌种的类别丰富度以及菌种数目均匀度两大指标。Alpha多样性越高表示菌群种类丰富度越好，菌种数目越均匀，菌群愈稳定。Alpha多样性指标值采用四种不同的计算指标分析求得。

图5 样品进化树分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of the samples

图4 样品聚类图Fig.4 Clustering chart of the samples

2.6.1 香隆指数(Shannon index)

Shannon index 是根据样品中的物种种类以及每个物种的比例来计算的多样性指标，计算公式如下：

H′表示Shannon index 值，R表示样品中物种的种类数，pi第i个物种所占百分比；

Shannon index值与样品深度的关系见图6。横坐标表示取样深度即序列的条数，纵坐标表示Shannon index值，菌种分布越均匀，其Shannon值越大。结果表明I19样品微生物分布最均匀，I1、I10、I4次之，I22、I16、I13、I25再次之，最后是I7。

图6 香隆指数Fig.6 Shannon indexes of the samples

2.6.2 Chao1

Chao1是一个可以不基于进化树来进行评价物种丰度的一个指数，计算的公式为：

其中，Sobs是观察到的物种数，n1是观察到的singletons的种类数，n2是观察到的doubletons的种类数。Chao 1在低丰度样品特别多的时候更能体现真实的多样性情况；Chao 1值与样品深度的关系，见图7。横坐标表示取样深度即序列的条数，纵坐标表示Chao 1 Index值。结果表明I19样品微生物丰度最好，I4、I1、I10、I16、I22次之，最后是I25、I13、I7。

图7 Chao1 指数Fig.7 Chao1 indexes of the samples

2.6.3 观察细菌总数(Observed species)

Observed species是一个不基于进化树来对物种丰富度进行检测的指数，就是某次实验中观测到的种类数。Observed species与样品深度的关系见图8。横坐标表示取样深度即序列的条数，纵坐标表示OTUs的数目值。结果表明I19样品微生物最丰富，I1、I4、I10次之，I16、I22再次之，最后是I25、I13、I7。

图8 观察种类Fig.8 Observed types of the samples

图9 辛普森指数Fig.9 Simpson indexes of the samples

2.6.4 辛普森指数(Simpson index)

Simpson是一种立于分布格局的多样性的测度方法。是测量一个种群的集中程度或优势程度的。根据物种在样品中的比例来计算，公式如下:

其中Pi表示物种i的在样品中的比例。

Simpson值与样品深度的关系见图9。横坐标表示取样深度即序列的条数，纵坐标表示Simpson值，稀有种对Simpson值的影响较小，而常见种对其的影响较大。

2.7 不同pH饮用水对SPF小鼠肠道微生物多样性的影响

所有样品共有优势菌为硬壁菌门(Firmicutes)；拟杆菌门(Bacteroidetes)；蛋白菌门(Proteobacteria)，并占小鼠肠道细菌总数98%以上。结果见表3。

表3 各样品不同饲养阶段的优势菌(每个样品每个阶段列出占比前10的细菌)Tab.3 Dominant species of the samples at different stages of feeding (listed the top 10 bacteria of each sample at each stage)

3 讨论

在生物进化的漫长过程中，生物rRNA分子除了排列顺序有些非常缓慢的变化外，其功能几乎保持不变，从这个特性上可以检测出种系变化的关系。rRNA结构具有保守性和高变性。保守性揭示了生物物种的亲缘关系，是系统发育重建的重要线索。高变性揭示了生物物种核酸序列的不同特征，是鉴定属种的基础。细菌rRNA的类型有23S、16S和5S rRNA 3种，其长度分别为2900、1540、120 bp。5S rRNA虽最易分析，但由于核苷酸数量少，用于分析研究的遗传信息不够准确。23S rRNA含有最多的核苷数，几乎是16S rRNA的2倍，用于分析研究的遗传信息虽最准确但分析较困难。16S rRNA的核苷数相对适中，较易于分析，用于分析研究的遗传信息基本满足序列测定的分析比较，也成为动物胃肠道宏基因组学研究的一个重要的理论和实践基础[10]。根据16S rRNA的保守区和可变区的特性[11]，测定其基因部分序列即可达到样品分子鉴定的目的[12]，常用序列比对长度一般选为500 bp[13-16]，有的研究人员使用800 bp长度进行序列比对[17]。目前，16S rRNA/rDNA分子鉴定技术广泛用于微生物的遗传特征研究及分子差异的研究[18]。

人体内正常的菌群主要定植于小肠、回肠及结肠部位，这些菌群可直接参与宿主的物质代谢过程，进而影响人体健康，如Harold Tjalsma等[19]报道，肠道菌群失调是直肠癌发生的一大因素。Amandine Everard等[20]报道，肠道菌群失调能够引发肥胖和2型糖尿病。Christopher T. Brown等[21]报道，肠道菌群失调能够引发自身免疫性疾病如1型糖尿病。Osawa[22]及Smith[23]等研究报道动物的肠道菌群及其代谢产物能够影响宿主粘膜系统的发育、血管细胞的发生、肠道上皮细胞的更新、肠道功能的维持及参与宿主基因的表达及脂类的代谢调控。国内郭秀兰等[24]的研究表明拟杆菌属可能是一个好的脂肪沉积的生物标识。

本研究表明所有样品共有优势菌为硬壁菌门(Firmicutes)；拟杆菌门(Bacteroidetes)；蛋白菌门(Proteobacteria)，并占小鼠肠道细菌总数98%以上。这与Ley等2005[25]，2006[26]报道的硬壁菌门和拟杆菌门细菌占比超过哺乳动物肠道总细菌的98%的结果基本一致。硬壁菌门和拟杆菌门对健康有深远的影响，如肠道菌群与脂肪沉积的关系，Ley等2006[26]对肥胖人和瘦人肠道微生物的组成情况作了比较，对粪便细菌作了16S rRNA基因序列克隆测序并分类计算，发现肥胖人粪便中的硬壁菌门比瘦人高(P=0.002)，而拟杆菌门比瘦人低(P< 0.001)。刘祥等2005[27]采取体外培养和生化反应的方法对肥胖人和瘦人的肠道菌群进行了研究，发现肥胖人肠道菌群中拟杆菌门的含量显著高于瘦人。这些结果表明脂肪沉积与肠道菌群中硬壁菌门、拟杆菌门的数量或相对丰度密切关联。在本研究多样性分析中表明pH3.0组小鼠肠道微生物的分布相对均匀、种类丰富及相对好的生物丰度，说明肠道微生物生态稳定，有利于小鼠的健康(同批小鼠同时委托当地实验动物质量监督检测站做细菌、病毒、寄生虫的检测，其结果均为阴性)，也可能有利于减少肠道微生物对实验结果的影响，使实验数据具有更好的重复性。在长期规模化饲养条件下，选取pH 3.0饮用水的动物能较长时间维持动物肠道微生物多样性，稳定性达到一个平台，可以做为长期饲养的一种选择。因此本研究也为长期稳定维持动物质量的生产实践提供了理论与技术支持。

[1] 徐平，毛佳贤. 小鼠饮水酸化后细菌生长情况 [J].上海实验动物科学，1992，12(3): 157-159.

[2] Servick K. Mouse microbes may make scientific studies harder to replicate. 2016.8.16. http://www.sciencemag.org.

[3] Pei AY, Oberdorf WE, Nossa CW, et al. Diversity of 16S rRNA genes within individual prokaryotic genomes [J]. Appl Environ Microbiol, 2010, 76(12): 3886-3897.

[4] Zhang J, Kobert K, Flouri T, et al. PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR[J]. Bioinformatics, 2014, 30(5): 614-620.

[5] Vasileiadis S, Puglisi E, Arena M, et al. Soil bacterial diversity screening using single 16S rRNA gene V regions coupled with Multi-Million read generating sequencing technologies [J]. PLoS ONE, 2012, 7(8): e42671.

[6] Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J]. Nat Methods, 2010, 7(5): 335-336.

[7] Ahn J, Sinha R, Pei Z, et al. Human gut microbiome and risk for colorectal cancer [J]. J Natl Cancer Inst, 2013,105(24):1907-1911.

[8] Bray JR, Curtis JT. An ordination of upland forest communities of Southern Wisconsin [J]. Ecol Monogr, 1957, 27(4):325-349.

[9] Langille MGI, Zaneveld J, Caporaso JG, et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences [J]. Nat Biotechnol, 2013, 31(9): 814-821.[10] 吴旧生, 王鹏歧, 刘月环. 宏基因组学与动物病原微生物检测 [J]. 中国比较医学杂志, 2014, 24(9): 72-77.

[11] Woese CR. Bacterial evolution [J]. Microbiol Rev, 1987, 51(2): 221-271.

[12] Jones SW, Dobson ME, Francesconi SC, et al. DNA assays for detection, identification, and individualization of select agent microorganisms [J]. Croat Med J, 2005, 46(4): 522-529.

[13] Patel JB, Leonard DG, Pan X, et al. Sequence-based identification of Mycobacterium species using the MicroSeq 500 16S rDNA bacterial identification system [J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(1): 246-251.

[14] Tang YW, Von Graevenitz A, Waddington MG, et al. Identification of coryneform bacterial isolates by ribosomal DNA sequence analysis [J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(4): 1676-1678.[15] Hall L, Doerr KA, Wohlfiel SL, et al. Evaluation of the Micro Seq system for identification of mycobacteria by 16S ribosomal DNA sequencing and its integration into a routine clinical mycobacteriology laboratory [J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(4): 1447-1453.

[16] Tang YW, Ellis NM, Hopkins MK, et al. Comparison of phenotypic and genotypic techniques for identification of unusual aerobic pathogenic gram-negative bacilli [J]. J Clin Microbiol, 1998, 36(12): 3674-3679.

[17] Bosshard PP, Abels S, Zbinden R, et al. Ribosomal DNA sequencing for identification of aerobic gram-positive rods in the clinical laboratory (an 18-month evaluation) [J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(9): 4134-4140.

[18] Cai HY, Arehambanlt M, Gyles CL, et al. Molecular genetic methods in the veterinary clinical bacteriology laboratory:current usage and future applications [J]. Anim Health Res Rev, 2004, 4(2): 73-79.

[19] Tjalsma H, Boleij A, Marchesi JR, et al. A bacterial drive-passenger model for colorectal cancer: beyond the usual suspects [J]. Nat Rev Microbiol, 2012, 10(8): 575-582.

[20] Everard A, Belzer C, Geurts L, et al. Cross-talk between Akkermansia muciniphila and intestinal epithelium controls diet-induced obesity [J]. PNAS, 2013, 28(5): 9066-9071.

[21] Brown CT, Davis-Richardson AG, Giongo A, et al. Gut microbiome metagenomics analysis suggests a functional model for the development of autoimmunity for type 1 diabetes [J]. PLoS ONE, 2011, 6(10): e25792.

[22] Osawa R, Kuroiso K, Goto S, et al. Isolation of tannin-degrading lactobacilli from humans and fermented foods [J]. Appl Environ Microbiol, 2000, 66(7): 3093-3097.

[23] Smith AH, Mackie RI. Effect of condensed tannins on bacterial diversity and metabolic activity in the rat gastrointestinal tract [J]. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(2): 1104-1115.

[24] 郭秀兰. 猪肠道硬壁门和拟杆菌数量的检测及其相对丰度与脂肪沉积的相关性研究 [D]. 四川农业大学博士论文. 2009

[25] Ley RE, Backhed F, Turnbaugh P, et al.Obesity alters gut microbial ecology [J]. PNAS, 2005, 102(31): 11070-11075.[26] Ley RE, Turnbaugh PJ, Klein S, et al.Microbial ecology: Human gut microbes associated with obesity [J].Nature, 2006, 444(7122): 1022-1023.

[27] 刘祥，张朝武，潘素华，等. 不同体脂人群肠道主要菌群的定量分析 [J]. 卫生研究，2005, 34(6): 724-725.

Effect of drinking water at different pH on intestinal microbial diversityin SPF mice evaluated by high throughput sequencing

YU Qiang1,2#， LIU Yue-huan2#， WANG Zhi-yuan2， WU Jiu-sheng1*

(1.College of Animal Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China； 2.Zhejiang Academy of MedicalSciences, Hangzhou 310013)

Objective To study the effect of drinking water at different pH on intestinal microbial diversity in SPF mice. Methods Ninety 21-day-old SPF mice were randomly divided into three groups: drinking acidified water (pH 3.0), neutral water (pH 7.0) and alkaline water (pH 9.0), respectively, for 3 months, 30 mice in each group. 10 mice were sacrificed at the end of 4, 8 and 12 weeks in each group. Bacteria, virus and parasites in serum were detected according to the national standard for SPF. Then, primer sequences were designed according to the conservativeness of bacteria 16S rRNA, and libraries were constructed. Subsequently, the ileocecal contents were subjected to high-throughput sequencing (Illumina). 10 G data were obtained and analyzed. Results The sequencing results revealed that the intestinal microbial abundance of the mice receiving pH 3.0 drinking water was moderate with a high stability. Conclusions Under the conditions of large-scale breeding, the mice receiving pH 3.0 drinking water can maintain the intestinal microbial diversity for a long time, and reach a stable platform. This study provides theoretical and technical support for the stable long-term maintenance of animal quality production. It is also a specific application of gastrointestinal macrogenomics in animal quality control.

Intestinal microflora; 16S rRNA; High throughput sequencing; Drinking water; Mice

浙江省公益技术应用研究计划(2011C37096，2015C37102)；浙江省医药卫生平台骨干人才基金(2015RCA006)；浙江省自然科学基金(LY16H030011)。

余强(1980-)，男，实验师，硕士生，本科，研究方向：实验动物学。Email: yu_q2008@163.com；刘月环(1974-)，女，副研究员，博士后，研究方向：实验动物生物技术。Email: yuehuanliu@163.com.#共同第一作者

吴旧生(1969-)，男，副教授，博士，研究方向：实验动物医学。 Email: wjosh@zju.edu.cn

研究报告

R-33

A

1671-7856(2017) 07-0040-08

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.07.008

2016-12-21