幽门螺杆菌感染小鼠慢性胃炎模型的建立及评价

连大卫，扶丽君，许艺飞，任文康，操红缨，黄 萍

(广州中医药大学中药学院，广州 510405)

幽门螺杆菌感染小鼠慢性胃炎模型的建立及评价

连大卫，扶丽君，许艺飞，任文康，操红缨，黄 萍*

(广州中医药大学中药学院，广州 510405)

目的 建立幽门螺杆菌(H.pylori)感染动物模型，评价H.pylori相关慢性胃炎胃黏膜病理变化。方法 灌胃H.pyloriSS1菌株建立在体感染，感染后第2周后采用快速尿素酶法和PCR法检测感染成功率；确认感染成功后再分别继续饲养至6周和12周，建立H.pylori相关慢性胃炎动物模型。实验结束后，取胃腺体组织别进行HE和硼酸美兰染色，分析胃炎程度及H.pylori感染程度；生化法检测胃组织中髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)和过氧化氢酶(catalase，CAT)的含量变化；RT-qPCR法检测胃组织中COX-2、iNOS、TNF-α和IL-1β基因表达的变化。结果 与正常组相比，模型6周和12周组胃组织内可见H.pylori定植，并且黏膜层有不同程度的慢性炎性细胞浸润，腺体萎缩和肠化生情况；同时组织中CAT和SOD的含量明显下降，MPO和MDA的水平和COX-2、iNOS、TNF-α和IL-1β基因表达均有显著上升(P< 0.05 或P< 0.01)。结论通过灌胃给菌的方法可以成功将H.pylori定植于小鼠体内，并在定植的6周和12周后均可引起慢性炎性细胞的浸润，并使增强胃腺体组织内氧化应激水平和促炎基因的表达，但12周模型感染程度更深，出现腺体萎缩和肠化生的情况。

幽门螺杆菌；慢性胃炎；小鼠模型；氧化应激；促炎因子

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，H.pylori)是一种常见的人体感染细菌，属于弯曲杆状微需氧的革兰阴性菌，全球有一半以上的人口感染[1]，我国H.pylori的感染率在60%左右[2]。近年国内外对H.pylori是慢性胃炎、消化性溃疡和胃腺癌发生的主要诱导因素达成共识，并已被世界卫生组织列为I类致癌因子[3，4]。因此建立H.pylori感染的慢性胃炎动物模型对于探讨其致病机理、评估药物疗效和验证治疗方案等研究具有重要意义。H.pylori感染小鼠模型在近些年的研究中最为广泛[5，6]，本研究旨在通过建立不同的感染时间对模型动物体内胃炎的发展进行比较评分，并分析其胃组织内氧化应激水平与促炎因子的表达，探讨不同感染时间形成的胃炎程度与其病理机制，为优化模型奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物和细菌

C57BL/6小鼠，34只，SPF级雄性，5 ～ 6周龄，体重17 ～ 18 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京)2012-0001】，动物运输前抽取部分小鼠进行胃部PCR检测，确认小鼠未感染鼠源性幽门螺杆菌。实验动物饲养于广州中医药大学(大学城)实验动物中心【SYXK(粤)2013-0085】，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。H.pylori(SS1)由澳大利亚莫纳什大学Richard Ferrero教授馈赠。

1.2 仪器和试剂

Campylobacter agar base(Oxoid，批号1589242)；Brain-heart unfusion(Oxoid，批号1677862)；革兰氏染色液试剂盒(海博生物，批号HB8278)；细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生物，批号DP302-2)； Super Real Pre Mix × Plus(天根生物，批号03120)；FastQuant RT Kit(天根生物，批号03326)；Trizol Reagent(Thermo Life Technology，批号28218)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天，批号P0010S)；超氧化物歧化酶检测试剂盒(南京建成，批号20160306)；髓过氧化物酶检测试剂盒(南京建成，批号20160302)；丙二醛检测试剂盒(南京建成，批号20160304)；过氧化氢酶检测试剂盒(南京建成，批号20160309)；麦氏比浊仪(珠海贝索生物技术有限公司)； NU-5831E三气培养箱(Nuaire)；HVE-50高温灭菌锅(Hirayama)；生物安全柜(ESCO)；倒置显微镜(Olympus)；BioSpec-nano核酸分析仪(岛京)；CFX 96(Bio-Rad)；低温高速离心机(Eppendorf)。

1.3 实验方法

1.3.1 细菌培养与鉴定

(1)幽门螺杆菌的复苏和传代

将冻存的H.pylori菌株从超低温冰箱(-80℃)取出，复苏于弯曲杆菌琼脂培养基为基础，含7%脱纤维新鲜羊血及联合抗生素(万古霉素10 mg/L，甲氧苄氨嘧啶 5 mg/L、头孢磺啶 5 mg/L、两性霉素 5 mg/L)的平板上。倒置平板置于37℃，5%O2，10%CO2，85%N2的培养箱中复苏48 ～ 72 h。待细菌长满平板后，使用一次性无菌棉签刮取并重悬于的PBS中接种于新的培养基上，再生长48 ～ 72 h。

(2)幽门螺杆菌菌株的鉴定

使用一次性接种环取部分细菌，在载玻片上涂布均匀，酒精灯烤干片。使用革兰染色试剂盒染色细菌，在显微镜下使用油镜观察细菌形态。同时取少量菌液置于快速脲素酶试剂里，1 min后观察试剂颜色变化。

1.3.2 造模方法及感染检测

(1)动物分组

C57BL/6小鼠，34只雄性，随机分为空白对照组10只及感染组24只。感染组经口服H.pylori确认感染成功后，再随机分为模型6周对照组、模型12周对照组，每组8只。

(2)幽门螺杆菌感染方法

将经过鉴定取传至第二代的H.pylori(SS1)菌株，加入10%FBS的BHI培养液中调节成麦氏浓度为0.1的菌液，放入37℃微需氧环境下(5%O2、10%CO2和 85%N2，湿度95%)，120 rpm摇床上震荡培养16 ～ 18 h，使得H.pylori生长至对数生长期。取出菌液，0.25 mL只灌胃感染组小鼠，共灌胃3次，隔天一次，每次灌胃幽门螺杆菌前禁食12 h，灌胃完成后2 h后进食。感染组小鼠于给予2%的盐水直至开始给药，以增强细菌感染力。

(3)幽门螺杆菌感染检测方法

灌胃感染结束后一周，随机取8只感染组小鼠及2只空白对照组小鼠做感染检测，以确定H.pylori在动物体内感染定植。检测前小鼠禁食24 h，小鼠处死后，使用灭菌的手术器械，取出胃组织，沿胃大弯剪开胃部，使用无菌的PBS冲洗胃部残渣。取胃腺部随机分为2份，一份剪下后置于快速尿素酶试剂内；一份液氮急冻用于PCR检测。置于快速尿素酶试剂内胃腺部组织在37℃烘箱内孵育6 h，颜色变为红色表明感染成功。取另一份胃腺体组织，依据细菌DNA提取试剂盒说明书操作提取DNA。使用引物16s，扩增条件为94℃预变性2 min，94℃解链2 s，53℃退火2 s，72℃延伸30 s，35个循环。配置1.5%琼脂糖凝胶，100 V，35 min，5 μL上样量，对PCR扩增产物电泳检测。扩增产物目的长度为375 bp。引物设计结果见表1。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.3.3 病理学检测

饲养结束后，脱颈椎处死动物，采用无菌无酶处理后的手术器械剖腹取胃，沿胃大弯剪开，用生理盐水洗去胃内容物，沿胃小弯剪取从胃窦到胃体组织，分为3份，两份置于4%多聚甲醛中固定，分别做HE染色观察胃炎程度和硼砂美兰染色观察幽门螺杆菌感染状况并参考文献评分[7]；另一份液氮中速冻，后移至-70℃冰箱保存备用。

1.3.4 组织内氧化应激相关指标的测定

取出冻存组织，匀浆后再4℃， 12000 g离心5 min取上清液，分别参照MPO、SOD、 MDA和CAT检测试剂盒方法进行检测。

1.3.5 组织内促炎因子基因表达水平的测定

胃组织中总RNA提取及cDNA合成：参照TRIzol说明书方法提取胃组织的总RNA，在超紫外分光光度仪上测D(λ)260 nm/280 nm比值达到1.8 ～ 2.0后，按逆转入试剂盒操作方法得到cDNA。引物设计结果见表1。实时荧光定量RT-qPCR扩增程序用荧光定量检测试剂盒，在Bio-Rad荧光定量PCR仪上扩增。扩增条件：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃延伸60 s，40个循环。分析结果，得出各组内参基因和目的基因Ct值，运用2-△△Ct公式计算。

1.4 统计方法

2 实验结果

2.1 幽门螺杆菌感染检测结果

感染组动物胃腺体组织快速尿素酶试剂检测为红色，同时其PCR扩增可以得到长度为375 bp的16s产物。综上结果显示幽门螺杆菌成功在体感染，见图1。

注：A：快速尿素酶法检测H.pylori感染(左侧2管为空白对照组，RUT为阴性，显黄色；右侧8管 为感染组，RUT为阳性，显红色)；B：PCR检测H. pylori感染。图1 幽门螺杆菌鉴定结果Note. A: Rapid urease test of H. polyri infection. Left two tubes: yellow, control group, represent negative reaction. Right 8 tubes: red, infected group, RUT-positive. B: PCR identification of H. pylori infection.Fig.1 Identification of H. polyri

2.2 幽门螺杆菌感染模型病理切片结果

相比正常组，模型组6周的胃粘膜层显示出现单核细胞密集和浸润的慢性胃炎病理学变化，同时可见H.pylori感染，属于H.pylori相关慢性胃炎的阶段；模型组12周的胃粘膜层不仅表现出慢性炎症和H.pylori感染，而且出现了胃固有腺体减少，被炎性细胞取代，纤维组织增加的情况，属于H.pylori相关萎缩性胃炎；模型组6周和12周的胃黏膜层均少见中性粒细胞浸润，见图2、表2 ～ 6。

例数(n)慢性胃炎程度Degreesofchronicinflammation0123 P正常组Controlgroup87100模型组(6周)Infectedgroup，6weeks81700<001模型组(12周)Infectedgroup，12weeks81610<001

注：分数：无，0；轻度，1；中度，2；重度，3。

Note.Scores: normal, 0; mild, 1; moderate, 2; severe, 3.

表3 H. pylori感染小鼠胃组织切片活动性炎症程度Tab.3 Degrees of active inflammation in the gastric tissues of H. pylori-infected mice

注：分数：无，0；轻度，1；中度，2；重度，3。

Note. Scores: normal, 0; mild, 1; moderate, 2; severe, 3.

表4 H. pylori感染小鼠胃组织切片萎缩程度Tab.4 Degrees of glandular atrophy in the gastric tissues of H. pylori-infected mice

注：分数：无，0；轻度，1；中度，2；重度，3。

Note. Scores: normal, 0; mild, 1; moderate, 2; severe, 3.

表5 H. pylori感染小鼠胃组织切片肠化生程度Tab.5 Degrees of intestinal metaplasia in the gastric tissues of H. pylori-infected mice

注：分数：无，0；轻度，1；中度，2；重度，3。

Note. Scores: normal, 0; mild, 1; moderate, 2; severe, 3.

表6 H. pylori感染小鼠胃组织切片细菌定植程度Tab.6 Degrees of bacterial colonization in the gastric tissues of H. pylori-infected mice

注：分数：无，0；轻度，1；中度，2；重度，3。

Note. Scores: normal, 0; mild, 1; moderate, 2; severe, 3.

2.3 幽门螺杆菌感染模型胃组织中氧化应激相关指标表达结果

与正常组相比，模型组小鼠胃组织中CAT和SOD含量均有不同程度的下降；MPO和MDA含量均有显著上升，其中模型12周增加程度高于模型6周，见表7。

表7 H. pylori感染小鼠胃组织中氧化应激指标的表达Tab.7 Levels of oxidative stress indicators in the gastric tissues of H. pylori-infected mice

注：与正常对照组比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；与模型6周组比较，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the control group,ΔP<0. 05,ΔΔP< 0.01; Compared with the model of 6-week infected group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表8 H. pylori感染小鼠胃组织中相关促炎因子表达Tab.8 Expression levels of pro-inflammatory factors in the gastric tissues of H. pylori-infected mice

注：与正常对照组比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；与模型6周组比较，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the control group,ΔP< 0. 05,ΔΔP< 0.01; Compared with the model of 6-week infected group,*P< 0.05,**P< 0.01.

2.4 幽门螺杆菌感染模型胃组织中相关促炎因子表达结果

与正常组相比，模型组小鼠胃组织中COX-2、iNOS、TNF-α、IL-1β的基因表达均明显上升，其中模型12周促炎因子表达高于模型6周。见表8。

3 讨论

H.pylori(Sydney strain 1，SS1)是Lee等人从C57BL/6小鼠体内分离而出[8]，具有高致病性的致病岛(pathogenicity island)基因，能编码IV型分泌系统(T4SS)和毒素相关蛋白A(cytotoxin-associated protein A，CagA)，同时空泡毒素A(vacuolating cytotoxin A，VacA)表达也呈现阳性，足以导致宿主细胞在增殖，骨架重排，细胞连接，形态延伸与散射等方面的改变，破坏胃上皮细胞。此外，H.pylori感染还会通过与宿主免疫系统相互作用而激活免疫应答，招募而来的炎性细胞不仅会释放的促炎因子加剧局部炎症程度，而且会累积大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)[9，10]，原本这些活性物质具有清除外来微生物的作用，但H.pylori具备逃逸清除的功能，因此氧化应激生成的活性物质不仅无法杀灭细菌，反而破坏了机体自身系统的平衡并造成炎症等多种应激损伤，是导致最终相关胃炎发生的重要因素。

H.pylori在体感染的难点是需要有在体适应能力强的H.pylori菌株，本实验使用的菌株由澳大利亚莫纳什大学的Richard Ferrero教授馈赠，从C57BL/6小鼠在体分离出来之后体外共传5代的H.pylori(SS1)，细菌灌胃前在液体环境中培养16 ～ 18 h使其进入对生长数期，并让动物禁食4 ～ 12 h，灌胃完成后再禁食1 ～2 h便于H.pylori定植。除了细菌因素以外，作为实验感染对象的小鼠也需要严格的质量控制，鼠源性H.pylori在小鼠种群内的传染性极强，而被鼠源性H.pylori感染的小鼠不仅难以接种上SS1菌株，而且也无法保证实验的统一性，因此在实验前先使用PCR技术确定购置的小鼠胃部没有H.pylori感染也尤为重要。与此同时，造模期间给予2%的盐水也能增加H.pylori的定植成功率[11]。国内外文献中，虽有应用C57BL/6小鼠成功建立H.pylori相关胃炎模型的报道，但对于其病理机制探讨较少。本次实验不仅证明模型小鼠在感染6周后会出现慢性胃炎，感染12周后出现萎缩性胃炎；而且其胃组织中MDA、MPO的含量和COX-2、iNOS、TNF-α、IL-1β基因的表达均显著上升，SOD和CAT含量显著下降，并伴随着H.pylori定植时间的延长而加重；说明模型小鼠胃组织中促炎因子的表达不断增加，氧化-抗氧化平衡体统被打破，局部氧化应激程度持续加剧，最终表现出更严重的炎症损伤，推动H.pylori感染相关慢性胃炎的发展。本次实验所采用的动物造模方法成功率高，并探讨了模型的致病机理，为实验的重复以及进一步深人研究提供了基础。

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·专家问答·

问：大鼠脑脊液抽取方法

答：采集大鼠脑脊液可参考的方法有经皮穿刺延髓池抽取脑脊液法、直视下划破硬脊膜抽取脑脊液法和直视下微量进样器经硬脊膜穿刺抽取脑脊液法。方法一，是在非直视下操作，故要求操作者熟悉大鼠头颈部解剖结构，精确掌握进针点、角度与深度，并根据个体差异调整手法。方法二，简单方便，对操作者技术要求低，但是割破硬脊膜易造成脑脊液流失和少量的血污染，因此采集量以及采集效率会受影响。方法三，效果最佳，成功率可达100%，且污染率最低。方法要点：麻醉、固定大鼠，剪去背毛，两耳根的连线处剪开一横切口，中点纵向剪开，将皮分离用止血钳拉向两侧。紧贴大鼠颅底用镊子和止血钳逐层钝性分离各层肌肉，暴露出枕骨大孔。手持100 μL微量进样器，针尖斜面向上，与水平面呈20 ～ 30度角刺入枕骨大孔，进针深度大约2 ～ 3 mm。刚刺入时会有强烈的突破感，此时即可得到少许脑脊液，待固定针体后，继续缓慢抽取，采集量可达100 μL。

(感谢中国医学科学院医学实验动物研究所 张丽 的解答)

Establishment and evaluation of a mouse model of chronicgastritis induced byHelicobacterpylori

LIAN Da-wei, FU Li-jun, XU Yi-fei, REN Wen-kang, CAO Hong-ying, HUANG Ping*

(School of Chinese Meteria Medica, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China)

Objective To establish a mouse model ofH.pyloriinfection, and to evaluate the chronic pathological changes in the gastric mucosa associated withH.pyloriinfection. Methods 34 male 5～6-week old SPF C57BL/6 mice were used in this study. The mice were intragastrically administrated with a suspension ofH.pyloriSS1 strain. Two weeks after infection, rapid urease test and PCR were performed to confirm theH.pyloriinfection. Successfully infected mice were randomly divided into 3 groups including the control group, 6-week and 12-week infected groups. Samples of gastric mucosa were taken for pathological analysis using HE and borax methylene blue staining. The contents of myeloperoxidase (MPO), superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) and catalase (CAT) in the gastric tissues were detected by biochemistry, and the expression levels ofCOX-2,iNOS,TNF-αandIL-1βwere examined by RT-qPCR. Results Compared with the control group,H.pyloricolonization was observed in the gastric mucosa of the 6-week and 12-week infected mice, with chronic inflammatory cell infiltration, glandular atrophy and intestinal metaplasia to varying extents. The contents of CAT and SOD were significantly decreased, while the levels of MPO and malonaldehyde MDA, and the expression levels ofCOX-2，iNOS，TNF-αandIL-1βwere significantly increased (P<0.05 orP<0.01). Conclusions Intragastric administration withH.pyloriin C57BL/6 mice can be successfully used to generate the bacterial colonization, leading to chronic inflammatory cell infiltration, enhanced oxidative stress, and up-regulated expression of proinflammatory genes in the gastric glandular tissues at 6 and 12 weeks after inoculation. However, the inflammatory changes are more extensive in the mice at 12 weeks after infection, with glandular atrophy and intestinal metaplasia.

Helicobacterpylori; Chronic gastritis; Mouse model; Oxidative stress; Proinflammatory factors

国家自然科学基金资助项目(编号：81374043)；广东省科技计划资助项目(编号：2016A020217019)；广州市科技计划资助项目(编号：201607010336);广东省省级科技计划项目(编号：2013A022100001)。

连大卫(1988-)，男，博士研究生，专业：中药复方药理。E-mail：675836257@qq.com

黄萍(1960-)，女，教授，研究方向：中药新药与保健品开发。E-mail：hping331@126.com

研究报告

R-33

A

1671-7856(2017) 07-0006-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.07.002

2016-11-29