超声引导细针穿刺标本BRAF V600E及CyclinD1联合检测对于甲状腺癌患者颈部淋巴结转移的预测价值

戴维德,马 娜,王川予,吴明晓,张 征,陈 岚,何淑蓉,韩秀婕,郭发金*

(1北京医院超声科,北京 100730;2北京医院病理科;*通讯作者:E-mail:guofajinbh@163.com)



超声引导细针穿刺标本BRAF V600E及CyclinD1联合检测对于甲状腺癌患者颈部淋巴结转移的预测价值

戴维德1,马 娜1,王川予1,吴明晓1,张 征1,陈 岚2,何淑蓉2,韩秀婕1,郭发金1*

(1北京医院超声科,北京 100730;2北京医院病理科;*通讯作者:E-mail:guofajinbh@163.com)

目的 探讨利用超声引导细针抽吸标本进行BRAF V600E与CyclinD1联合检测对于甲状腺癌患者颈部淋巴结转移的预测价值。 方法 我院2015-08～2016-12收治的经超声引导细针抽吸细胞学检查确诊的甲状腺癌患者56例,所获得标本检测BRAF V600E和CyclinD1。对BRAF V600E和CyclinD1检测结果与随访结果进行回顾性分析。 结果 本组病例穿刺取材成功率为100%。56例患者中,39例检出BRAF V600E突变,突变检出率为69.6%;40例CyclinD1阳性表达,阳性表达率为71.4%。在30例既检测出BRAF V600E突变又发生CyclinD1阳性表达的病例中,手术病理发现颈部淋巴结转移18例,发生率为60%。其余26例病例中,手术病理发现颈部淋巴结转移5例,发生率为19.2%(5/26),既检测出BRAF V600E突变又发生CyclinD1阳性表达的病例颈部淋巴结转移发生率明显高于其余病例。 结论 利用超声引导细针抽吸标本进行BRAF V600E与CyclinD1联合检测对于甲状腺癌患者颈部淋巴结转移有一定的预测价值。

超声引导; 细针抽吸; 甲状腺癌; BRAF V600E; CyclinD1

ultrasound guidance; fine needle aspiration; thyroid carcinoma; BRAF V600E; CyclinD1

甲状腺癌(thyroid carcinoma,TC)是最为常见的内分泌系统恶性肿瘤。其中乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)发生率尤为最高,占全部TC的80%-85%[1]。由于TC发病率的快速增长,对于TC的预防、诊断和治疗成为当前肿瘤研究的一个重点。文献报道其颈部中央区淋巴结转移率为20%-60%[2],而超声检查作为目前颈部淋巴结病变的首选检查方法,对于较深位置或较小的颈部转移性淋巴结的检出率并不高,不能作为指导颈部淋巴结清扫的预测指标。有研究报道BRAF V600E突变及CyclinD1阳性表达与PTC不良预后相关[3]。本研究旨在探讨利用超声引导细针抽吸标本进行BRAF V600E突变及CyclinD1联合检测与PTC患者颈部淋巴结转移的相关性,为PTC手术的必要性及颈部淋巴结清扫的实施提供分子诊断依据。

1 对象和方法

1.1 对象

我院2015-08～2016-12收治的经超声引导细针抽吸细胞学检查(ultrasound-guided fine-needle aspiration biopsy,UG-FNAB)确诊手术治疗的TC患者56例,其中男16例,女40例;年龄23-67岁,平均年龄(46.5±3.2)岁。本组病例中甲状腺结节直径在0.3-1.5 cm。FNA实施指征:具有超声可疑恶性征象(形态不规则、纵横比大于1、边界模糊不清、极低回声、微钙化、中央型血流)。在行甲状腺穿刺前常规检测凝血功能、血常规;医生向患者或其家属详细交代超声引导穿刺的方法、目的、注意事项及可能的并发症,并签署知情同意书。

1.2 方法1.2.1 设备器材 GE LOGIQ E8型彩色多普勒超声成像系统,探头频率6-15 MHz。穿刺器材:日本八光CL型23G吸引活检针及10 ml一次性注射器各2支。

1.2.2 超声引导下穿刺取材 患者常取仰卧位或侧卧位,充分显露穿刺部位,先进行甲状腺常规超声检查,选择最佳穿刺点、测量进针深度并完成体表定位。穿刺部位常规消毒铺巾,2%利多卡因局麻后,手持活检针,在彩超引导下避开大血管、神经及气管等重要组织和脏器,进针到达肿块边缘。拔出针芯并接10 ml注射器,穿刺入肿块内后,提拉注射器针芯至2 ml刻度处,使注射器保持负压状态,反复旋转抽吸3-5次后改变进针方向,使针头在肿块内呈扇形朝不同方向抽吸,当注射器乳头内出现吸取物后,去负压退针。第一针取材常规涂片2-3张,置入95%乙醇固定液中送病检。穿刺部位无菌纱布覆盖并以适当力量压迫穿刺点10 min。第二针取材注入液基薄层细胞学检测(TCT)小瓶中并送病检。穿刺部位无菌纱布覆盖并以适当力量压迫10 min。观察20 min无不良反应方可离开。1.2.3 BRAF V600E基因检测 受阻突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)方法检测BRAF V600E基因突变状态:取甲状腺穿刺涂片,HE染色后,刮取细胞置于Eppendorf管中(尽量多刮取,保证肿瘤细胞数量≥200个)。提取基因组DNA操作流程按DNA提取试剂盒(厦门艾德诊断有限公司)说明书操作。ARMS方法检测BRAF V600E基因突变,采用BRAF突变检测试剂盒(厦门艾德诊断有限公司),实时荧光定量PCR仪器为ABI 7500 Fast型(美国Applied Biosystems公司)。实验操作和结果判断按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 免疫组化 抗体选用CyclinD1。将细胞块脱蜡和水化,胰酶抗原修复,阻断内源性过氧化物酶。先加入CyclinD1抗体,再加入加酶标聚合物。随后DAB显色、复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶和盖玻片封片。1.2.5 结果判读 Cyclin D1的阳性表达定位于细胞核。阳性细胞着色特征为棕黄色或棕褐色细颗粒样分布。评分标准采用半定量积分法,将染色强度分3级:无着色记1分,浅着色记2分,棕黄色或棕褐色记3分;阳性细胞百分数≤5%为0分,>5%-25%为1分,>25%-50%为2分,>50%-75%为3分,>75%为4分。上述两项评分的乘积为最后得分:0-1分为阴性(-);2-3分为阳性(+,++);>4分为强阳性(+++)。(+) 及以上评为阳性表达。

1.2.6 最终诊断标准 以TC手术病理学检查结果为最终明确诊断的标准。

1.3 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件,行χ2检验。

2 结果

2.1 超声引导细针抽吸标本BRAF V600E与CyclinD1检测

超声引导细针抽吸标本BRAF V600E与Cyclin D1检测及其结果见图1-3。本组病例穿刺取材成功率为100%。56例患者中,39例检出BRAF V600E突变,突变检出率为69.6%;40例CyclinD1阳性表达,阳性表达率为71.4%。

图1 超声引导甲状腺结节穿刺Figure 1 Ultrasound-guided fine needle aspiration of thyroid node

样本扩增曲线(蓝色)未升起，BRAF基因未发生突变样本扩增曲线(蓝色)升起，BRAF基因突变图2 BRAF基因扩增曲线Figure2 AmplificationcurveofBRAFgene

图3 CyclinD1阳性表达(DAB染色,×200)Figure 3 Positive expression of CyclinD1 (DAB staining,×200)

2.2 BRAF V600E与CyclinD1联合检测与颈部淋巴结转移的相关性

在30例既检测出BRAF V600E突变又发生CyclinD1阳性表达的病例中,手术病理检查发现颈部淋巴结转移18例,发生率为60.0%(18/30)。其余26例病例中,手术病理发现颈部淋巴结转移5例,发生率为19.2%(5/26)。

BRAF V600E突变及CyclinD1阳性表达的病例颈部淋巴结转移发生率明显高于其余病例(χ2=9.57,P<0.01)。

表1 BRAF V600E与CyclinD1联合检测TC患者颈部淋巴结转移的结果 (例)

Table 1 Combined detection of BRAF V600E and CyclinD1 in TC patients with cervical lymph node metastasis (cases)

BRAFV600ECyclinD1颈部淋巴结转移阳性阴性合计阳性181230阴性52126合计233356

3 讨论

TC作为最常见的头颈部恶性肿瘤,约占所有恶性肿瘤的1%,其中又以PTC所占比例最大。近30年来,我国的TC发病率由约10/100万上升到(30-40)/100万,美国则由约49/100万上升到143/100万,增长了300.0%[4]。TC已然严重威胁着人类健康。高分化的PTC,其肿瘤细胞生长缓慢,患者预后较好,10年生存率大于90%,但仍有5%-20%的患者出现复发及远处转移。而颈部中央区淋巴结转移率更是高达20%-60%,而超声检查作为目前颈部淋巴结病变的首选检查方法,对于较深位置或较小的颈部转移性淋巴结的检出率并不高,不能作为指导颈部淋巴结清扫的预测指标[5]。随着分子诊断技术的不断提高,对与TC相关的分子标志物的研究也越来越深入,这些标志物对于TC的诊断、预后、治疗方案的选择能发挥重要作用[6]。本研究在超声引导下,行甲状腺结节细针穿刺,对其穿刺标本进行BRAF V600E及CyclinDl检测,研究其与PTC患者颈部淋巴结转移的相关性,为PTC术中颈部淋巴结清扫实施的必要性提供分子诊断依据。

研究表明,基因突变是肿瘤发生的重要因素,RAS-RAF-MEK-ERK-MARK是诱发细胞核内反应的重要转导通路之一。BRAF基因位于RAS下游,是启动PTC肿瘤癌变的关键基因之一,参与肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡。BRAF蛋白的主要功能是传递细胞膜上的信号,野生型 BRAF平时处于静止状态,执行任务时转为活化状态。而BRAF基因突变致使BRAF蛋白持续激活,不需要依赖RAS信号即可使 MEK1/2和 ERK1/2激酶磷酸化,从而使细胞发生异常改变。BRAF V600E突变作为最常见的变异形式,约占所有BRAF突变的95%[7]。近期一项Meta分析结果显示,BRAF突变与患者的复发、淋巴结转移、甲状腺外侵犯、肿瘤更高分期有关[8]。CyclinD1属于细胞周期蛋白家族,是一种重要的细胞周期正性调控因子。它主要在细胞周期G1进入S期过程中发挥调节作用。正常生理状态下,CyclinD1在细胞进入S期后会快速裂解。如未发生裂解而表现为过表达,细胞周期的正常发展过程随之会受到影响;表现为细胞增殖加快,从Gl期快速进入S期,最终发生癌变。研究发现 CyclinD1的过表达与TC的发生、发展及不良预后密切相关,可作为鉴别甲状腺结节良、恶性及评估TC侵袭、转移能力的分子指标之一[9-11]。

本研究应用超声引导细针抽吸所得标本,对BRAF V600E及CyclinD1进行联合检测,结果显示:56例患者中,BRAF V600E突变检出率为69.6%;CyclinD1阳性表达率为71.4%。在30例既检测出BRAF V600E突变又发现CyclinD1阳性表达的病例中,手术病理发现颈部淋巴结转移18例,发生率为60.0%。而其余26例病例颈部淋巴结转移为5例,发生率仅为19.2%。BRAF V600E突变及CyclinD1阳性表达的病例颈部淋巴结转移发生率明显高于其余病例。表明BRAF V600E突变及CyclinD1阳性表达与PTC患者颈部淋巴结转移的有一定程度的相关性,可作为评估PTC侵袭、转移能力的分子指标。从而提示临床医生及患者术中中央区淋巴结清扫及术后严密随访的必要性[12]。

总之,利用超声引导细针抽吸所得标本检测BRAF V600E及CyclinD1简便实用、安全可靠,患者依从性好,结果与PTC患者颈部淋巴结转移发生率具有较高程度的相关性,是影响PTC患者颈部淋巴结转移的重要危险因素,可以作为实施PTC颈部淋巴结清扫术的分子诊断依据之一,具有较高的临床应用价值。

[1] Heg L.Clinical practice the thyroid nodule[J].N Engl J Med,2004,351(17):1746-1771.

[2] 刘木元,杨熙鸿,郭海鹏,等.cN0甲状腺乳头状癌侧颈淋巴结转移特点及其相关因素[J].肿瘤研究与临床,2012,24(6):410-413.

[3] 侯卫东,胡学信,刘艳峰.甲状腺乳头状癌中CyclinD1表达和BRAFV600E突变的相关性及意义[J].临床与实验病理学杂志,2014,30(12):1386-1390.

[4] 徐书杭,刘超.甲状腺癌的分子诊断——94届美国内分泌年会[J].中华内分泌代谢杂志,2012,28(8):691-694.

[5] Stulak JM,Grant CS,Farley DR,etal.Value of preoperative ultrasonography in the surgical management of initial and reoperative papillary thyroid cancer[J].Arch Surg,2006,141(5):489-494.

[6] Xing M,Alzahrani AS,Carson KA,etal.Association between BRAF V600E mutation and mortality in patients with papillary thyroid cancer[J].JAMA,2013,309(14):1493-1501.

[7] Tafano RP,Teixeira GV,Bishop J,etal.BRAF mutation in papillary thyroid cancer and its value in tailoring initial treatment:a systematic review and meta-analysis[J].Medicine,2012,91(5):274-286.

[8] Fnais N,Soobiah C,Al-Qahtani K,etal.Diagnostic value of fine needle aspiration BRAF(V600E) mutation analysis inpapillary thyroid cancer:a systematic review and meta-analysis[J].Hum Pathol,2015,46(10):1443-1454.

[9] 王前,邓晶,蒋永新.CyclinD1 的研究进展[J].现代肿瘤医学,2009,17 (2):350-353.

[10] Opitz OG,Suliman Y,Hahn WC,etal.Cyclin D1 overexpression and p53 inactivation immortalize primary oral keratinocytes by a telomerase-independent mechanism[J].J Clin Invest,2001,108(5):725-732.

[11] Fagone P,Nicoletti F,Vecchio GM,etal.CyclinD1 in pediatric neuroblastic tumors:a microarray analysis[J].Acta Histochem,2015,65(52):16-25.

[12] 戴维德,吴明晓,王川予,等.BRAF V600E检测对于老年患者UG-FNAB诊断不明确的甲状腺结节的应用价值[J].中华老年医学杂志,2016,35(7):736-739.

ObjectiveTo investigate the predictive value of combined detection of BRAF V600E and CyclinD1 in specimens by ultrasound-guided fine-needle aspiration from metastatic cervical lymph nodes in patients with thyroid carcinoma.MethodsFifty-six patients with thyroid carcinoma diagnosed by ultrasound-guided fine-needle aspiration cytology admitted to our hospital from August 2015 to December 2016 were enrolled in this study.The obtained samples were used for combined detection of BRAF V600E and CyclinD1.The results and the follow-up data were retrospectively analyzed and compared.ResultsThe success rate of puncture was 100%(56/56).Among 56 cases,39 cases had BRAF V600E mutation,and the mutation detection rate was 69.6%.CyclinD1 positive expression was detected in 40 cases,and the positive expression rate was 71.4%(40/56).Among 30 cases of both the detection of BRAF V600E mutation and CyclinD1 positive expression,18 cases(60.0%) of cervical lymph node metastasis were found according to surgical pathology.Among the other 26 cases,cervical lymph node metastasis was found in 5 cases,and the incidence was 19.2%(5/26).The incidence of cervical lymph node metastasis with both BRAF V600E mutation and CyclinD1 positive expression was significantly higher than that of the other patients.ConclusionThe combined detection of BRAF V600E and CyclinD1 in specimen by ultrasound-guided fine-needle aspiration in patients with thyroid carcinoma can be useful in predicting the cervical lymph node metastasis.

北京医院临床新技术创新课题(20160001)

戴维德,男,1971-09生,博士,主任医师,E-mail:dai.weide@126.com。

2017-02-27

R736.1

A

1007-6611(2017)06-0589-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.06.017

Predictive value of combined detection of BRAF V600E and CyclinD1 by ultrasound-guided fine needle aspiration for cervical lymph node metastasis in patients with thyroid carcinoma

DAI Weide1,MA Na1,WANG Chuanyu1,WU Mingxiao1,ZHANG Zheng1,CHEN Lan2,HE Shurong2,HAN Xiujie1,GUO Fajin1*(1DepartmentofUltrasound,BeijingHospital,Beijing100730,China;2DepartmentofPathology,BeijingHospital;*Correspondingauthor,E-mail:guofajinbh@163.com