中国黑孢壳属1新纪录种(黑孢壳目：长喙壳科)1)

赵佳 晁开瑞 刘忠玄 刘雪峰

(东北林业大学，哈尔滨，150040) (巴音郭勒蒙古自治州农科院) (东北林业大学)



中国黑孢壳属1新纪录种(黑孢壳目：长喙壳科)1)

赵佳 晁开瑞 刘忠玄 刘雪峰

(东北林业大学，哈尔滨，150040) (巴音郭勒蒙古自治州农科院) (东北林业大学)

记述了黑孢壳属的中国新纪录种内生黑孢壳菌(Melanosporadamnosa)。该种从黑龙江省孟家岗林场的平欧榛子(Corylusheterophylla×Corylusavellana)3年生枝条中分离获得，通过形态学和分子生物学方法进行了鉴定，提供了该新纪录种的形态学特征和系统发育树。标本保存在东北林业大学。

黑孢壳属；内生黑孢壳菌；新纪录种；中国

Melanospora;Melanosporadamnosa(Sacc.) Lindau; New record; China

黑孢壳属(Melanospora)是长喙壳科中最大的属，该属中50多个种，由Corda(1837)建立，其中包括Ceratostomachionea和2个新种Melanosporazamiae和Melanosporaleucotricha[1]。1895年，SphaerodermadamnosumSacc.由Saccardo和Berlese首次描述[2]。后期，该种的分类地位发生改变，更改到黑孢壳属，并由Engler和Prantl(1897)重命名为Melanosporadamnosa(Sacc.) Lindau(内生黑孢壳菌)。该物种在欧洲广泛分布，也分布在英国，孟加拉国和突尼斯[3]。然而，M.damnosa在中国还未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料

修枝的3年生平欧榛子(Corylusheterophylla×Corylusavellana)枝条采集于黑龙江省孟家岗林场，M.damnosa(KY575977.1)菌株从其3年生枝条中分离获得。

1.2 方法

将平欧榛子3年生枝条去皮，并剪成厚为0.2 cm的木块，再将木块平均分为4小块，待用。将若干个小块用纱布包好，放入m(CaClO)∶m(水)=1∶14的溶液中，表面消毒1 min，并用无菌水冲洗3次，然后用无菌滤纸将表面残留的水吸干，得到试验样品。每5个样品放入马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)(去皮的马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 L)中，25 ℃，黑暗条件下培养。培养20～30 d时，形成子囊壳。通过单孢分离法，获得单个孢子，在PDA培养基上培养。25 ℃，黑暗条件下培养7 d，菌丝可覆盖整个培养皿；大约1个月时，单孢分离菌落形成子囊壳。

1.2.1 形态学方法

将单孢萌发形成的子囊壳，放入显微镜下观察。测量子囊壳、颈长、颈顶端直径、颈基部直径、刚毛、子囊和子囊孢子的大小。用OLYPUSBX5测量数据，并拍摄形态学图片。使用Photoshop CS6对显微照片进行处理。

1.2.2 分子方法

用快捷型植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech (Beijing) Co.,LTD.)，提取培养7 d的单个孢子萌发形成的菌丝中的DNA。将获得的DNA用PCR仪进行扩增，ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCGCTTATTGATATGC)分别作为扩增时正反向的引物。将PCR扩增产物送至Sangon Biotech(北京)有限公司进行测序。将测序结果用NCBI Blast进行分析，并评估该测序物种和保藏在GenBank数据库中的其他相关菌株之间的系统发育关系。将测序结果上传至GenBank数据库中，获得的编号为KY575977.1。通过MEGA 5.1和Clustal X2.1软件，使用邻位相连法对测序菌株(KY575977.1)和GenBank数据库中的近缘种构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 形态学

单个萌发的子囊孢子，在PDA培养基中，25 ℃，黑暗条件下培养7 d，菌落覆满直径为90 mm的培养皿。菌落白色，背面浅黄色。培养约1个月时，形成子囊壳。无无性阶段。

子囊壳球形，单个，表生，疏生绒毛，淡黄色至橙棕色，直径170～270 μm；颈70～150 μm，短圆锥形，基部直径57～87 μm，顶端直径37～52 μm，顶部有呈环状的透明的刚毛，长150～230 μm。子囊倒梨形或宽棍棒形，(25～55)μm×(17～35)μm，含8个孢子，子囊很快消解。子囊孢子菱形至菱形椭圆形，棕色，光滑，两端具萌发孔，(18～23)μm×(11～15)μm。

研究标本：2016年5月，在黑龙江省孟家岗3年生修枝平欧榛子的枝条中分离获得菌株(KY575977.1，图1)。

a、b.子囊果；c、d.颈和刚毛；e.子囊；f.孢子；g.萌发的孢子；h.菌落形态(PDA培养基)。

2.2 分子系统学

在NCBI Blast系统中，分离菌株M. sp.(KY575977.1)的ITS1-5.8S和rDNA-ITS2区域与GenBank数据库中的菌株M.damnosa(CBS 113681)的相似度为99%。用分离菌株与近缘菌株构建的系统发育树中，分离菌株M. sp.(KY575977.1)与菌株M.damnosa(CBS 113681)在同一分支上，亲缘关系最近，可信度为99(图2)。

3 讨论

本研究运用形态学和分子系统发育学方法，将从3年生平欧榛子枝条上分离的菌株鉴定为内生黑孢壳菌，为中国新记录种。但在已知的记载中，该物种侵染谷物，如死亡马铃薯的茎[3]和玉米的茎[4]，并未在平欧榛子木材组织中发现。据记载，M.damnosa是Gonatobotryssimplex的有性型，并且是异宗配合[4]。但在本研究中，单个孢子萌发形成的菌落可形成子囊壳，因此该菌株为同宗配合，可能由于不同寄主或不同菌株使该物种的有性生殖特性发生改变。并且，通过后期的研究发现，由单个孢子萌发形成的子囊壳的数量明显少于由多个孢子萌发形成的子囊壳的数量。同时，该分离菌株未发现其存在无性型。在国内河北省，吴文平在高粱的种子上，曾分离得到该种的无性型Gonatobotryssimplex[5]，但未提到它具有有性阶段。因此，M.damnosa无性型的产生条件，以及有性型和无性型之间的关系还需要进一步研究。

图2 M. sp. KY575977.1与GenBank数据库中的近缘菌株的系统发育树

[1] FÉLIX Y M. Soil ascomycetes from different geographical regions[D]. Tarragona: Universitat Rovira I Virgili,2015.

[2] SACCARDO P A, BERLESE A N. Una nuova malattia del Frumento[J].Rivista Patologia Vegetale,1895,4:56-66.

[3] CANNON P F, HAWKSWORTH D L. A re-evaluation ofMelanosporacorda and similar pyrenomycetes, with a revision of the British species[J]. Botanical Journal of the Linnean Society,1982,84(2):115-160.

[4] NADER G V.Gonatobotryssimplexand its teleomorph,Melanosporadamnosa[J]. Mycological Research,1989,93(1):67-74.

[5] 吴文平.河北省丝孢菌研究Ⅴ.节簇孢属、小枝双孢属和斯佩霉属[J].河北省科学院学报,1991,8(4):58-62.

赵佳，女，1992年8月生，东北林业大学林学院，硕士研究生。E-mail:573737927@qq.com。

刘雪峰，东北林业大学林学院，研究员。E-mail:757489401@qq.com。

2017年2月22日。

S763.15

1)国家林业局林业公益性行业科技专项(201004079)。

A Newly Recorded Species of the GenusMelanospora(Melanosporales, Ceratostomataceae) in China//Zhao Jia(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China); Chao Kairui(Bayinggolin Mongol Autonomous Prefecture Academy of Agricultural Sciences); Liu Zhongxuan, Liu Xuefeng(Northeast Forestry University)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(7)：98-100.

责任编辑：程 红。

A species ofMelanosporadamnosabelonging to the generaMelanosporais presented, and the species is newly recorded from China. This species was separated from triennial branches stems of stumped hazelnuts in the Mengjiagang Town, Heilongjiang Province, and was identified and characterized using morphological and molecular methods. Photographs of adults, figures of the genital structures and phylogenetic tree were provided. The specimens are stored in Northeast Forestry University.