Hela细胞增殖抑制模型结合离心超滤质谱筛选中药抗癌药物

魏忠宝，马 蕾，刘 舒，刘志强，石 毅，曲晓波

(1.长春中医药大学，吉林 长春 130117；2.中国科学院长春应用化学研究所，吉林 长春 130022；3.吉林大学药学院，吉林 长春 130012)

Hela细胞增殖抑制模型结合离心超滤质谱筛选中药抗癌药物

魏忠宝1，马 蕾2，刘 舒2，刘志强2，石 毅3，曲晓波1

(1.长春中医药大学，吉林 长春 130117；2.中国科学院长春应用化学研究所，吉林 长春 130022；3.吉林大学药学院，吉林 长春 130012)

采用基于MTT比色法的Hela细胞增殖抑制模型评价中药提取物的抗癌活性，并利用离心超滤质谱方法对活性最强的中药提取物中抗癌活性成分进行筛选和鉴定。结果表明，长春花提取物对Hela细胞增殖的抑制活性最强，与阳性对照药阿霉素相当，且抑制活性与给药浓度呈正相关。延胡索提取物在3个不同给药浓度下也可以显著抑制Hela细胞的增殖。三尖杉、黄连和喜树果提取物在高浓度时能够显著抑制Hela细胞的增殖，而刺五加提取物则没有明显抑制作用。利用离心超滤质谱从长春花提取物中筛选得到2种存活素基因启动子片段结合剂和6种钙调蛋白结合剂，经多级串联质谱分析鉴定，分别为蛇根碱、鸡骨常山碱、它波宁、环氧长春碱、长春新碱和21’-氧代环氧长春碱。本研究可为中药抗癌药物的筛选提供一种简便、快速的方法。

离心超滤质谱；Hela细胞；中药；筛选；抗癌

中草药具有资源丰富、作用温和以及抗肿瘤疗效确切等特点，已成为抗肿瘤药物研发的热点[1-2]。然而，中药资源库庞大、中药化学成分复杂，并且其药效的发挥往往是多个活性成分作用于不同的生物靶分子的共同结果，如何有效、快速筛选并鉴定抗癌活性成分已成为目前研究中药抗癌药物亟待解决的问题之一。充分利用现代肿瘤学的研究成果并结合现代分析技术，建立科学合理的抗肿瘤药物筛选模型和高效可靠的方法，是研制疗效好、作用机理清楚的中药抗肿瘤新药的唯一途径。

质谱技术具有高灵敏度、高选择性和应用快捷等优点，在中药复杂体系研究中得到了广泛应用[3-4]，尤其与其他分离分析技术的联用，可以实现对中药复杂体系中活性成分的快速筛选和鉴定[5]。其中，离心超滤质谱技术常用于研究小分子药物与生物靶分子之间的相互作用，主要原理是将药物与生物靶分子混合，得到活性分子—生物靶分子复合物和游离的非活性小分子混合溶液，将混合溶液置于可以按分子质量不同截留部分化合物的超滤管中，通过离心使生物靶分子及其复合物被膜挡在一侧，游离态的小分子则自由通过超滤膜，实现活性分子与非活性分子的分离，然后，利用LC/MS联用技术对这些活性分子进行分离和鉴别。该方法应用简单、操作便捷，可以针对与疾病相关的生物靶分子，从复杂体系中快速筛选得到活性成分，同时借助质谱强大的定性能力对活性成分进行结构解析。该方法已被广泛应用于中药复杂体系活性成分筛选研究[6-7]。

本研究拟采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐比色法(MTT比色法)考察中药提取物对Hela细胞的增殖抑制作用[8]，对其抗癌活性进行初步评价。然后，选取与肿瘤细胞增殖和凋亡密切相关的存活素基因启动子DNA片段和钙调蛋白作为靶点[9-12]，利用离心超滤质谱法对抑制活性最强的中药提取物进行活性成分的进一步筛选与鉴定。

1 实验部分

1.1主要仪器与装置

LTQ XLTM线性离子阱质谱仪：美国Thermo公司产品，配有电喷雾离子源(ESI)及Xcalibur1.2数据处理系统；Waters H-Class超高效液相色谱仪：美国Waters公司产品，配有光电二级阵列管检测器和Empower色谱工作站；Eppendorf 5810R台式高速冷冻离心机：德国Eppendorf 公司产品；GENios酶标仪：瑞士Tecan公司产品；Cary50紫外-可见分光光度计：美国Varian公司产品；CO2培养箱：日本Sanyo公司产品；超净工作台：江苏安泰公司产品。

1.2主要材料与试剂

Hela细胞株：由中科院细胞库提供；合成存活素基因启动子片段(MW 8526.5 Da)对应的两条单链DNA序列为5’-ACGCGGCGGGAGGA-3’和5’-TCCTCCCGCCGCGT-3’：大连宝生物工程有限公司合成；钙调蛋白(MW 16 792 u)：美国Sigma-Aldrich公司产品；阿霉素单体：浙江海正药业股份有限公司产品；长春花、三尖杉、延胡索、黄连和刺五加：购于同仁堂长春药店；喜树果：中国药品生物制品检定所产品；PRMI1640细胞培养液：美国Hyclone公司产品；胎牛血清：杭州四季青公司产品；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)：美国Sigma公司产品；24和96孔细胞培养板：美国Falcon公司产品；YM-3超滤膜(截留分子质量为3 ku，超滤膜材质为再生纤维素)：美国Millipore公司Amicon Ultra-0.5系列产品；醋酸铵和醋酸钙：均为色谱级，美国Fluka公司产品；甲醇：色谱级，美国Fisher Chemical公司产品；纯净水：经美国Milli-Q水处理系统纯化。

1.3样品制备

1.3.1中药提取物制备 称取2 g干燥的中药材粉末，加入20 mL 75%乙醇-水溶液，室温超声提取40 min。然后，取上清液置于40 ℃水浴中，氮气吹干，用100 μL DMSO溶解并用水定容至5 mL，得到生药含量为0.4 g/mL提取液。过0.22 μm有机相滤膜制得的储备液于4 ℃保存，备用。

1.3.2双链DNA的合成 将单链DNA分子分别溶于Milli-Q水中，配制成2 mmol/L储备液。分别取100 μL含两条互补单链DNA分子的溶液于200 μL 100 mmol/L醋酸铵溶液中混合，90 ℃下保持15 min，然后缓慢冷却至室温并过夜，即退火形成浓度为500 μmol/L双链DNA溶液。

1.3.3钙调蛋白配制 将钙调蛋白加少量Milli-Q水溶解，钙调蛋白浓度通过紫外分光光度计测定并调整至180 μmol/L，其浓度根据ε280nm=3 300 L·mol-1·cm-1确定，于-20 ℃保存备用。实验开始时，将20 μL不含钙离子的钙调蛋白储备液用80 μL 12.5 mmol/L醋酸钙-62.5 mmol/L醋酸铵溶液稀释，于25 ℃水浴中反应10 min，得到终浓度为36 μmol/L钙离子和钙调蛋白(Ca2+·CaM)复合物溶液。

1.4实验条件

1.4.1色谱条件 色谱柱：迪马C18柱(150 mm×4.6 mm×5 μm)；流动相：A为乙腈，B为0.5%醋酸水溶液；流动相流速：0.5 mL/min；进样量：10 μL；检测波长：270 nm；柱温：30 ℃；梯度洗脱程序：0～15 min(10%～24%A)；15～30 min(24%～100%A)；30～60 min(100%A)。

1.4.2质谱条件 电喷雾电离源(ESI)，正离子全扫描模式，扫描范围m/z100～1 000；喷雾电压：4.5 kV；毛细管温度：240 ℃；鞘气和辅助气均为N2，流速分别为27 L/h和90 L/h；碰撞气为He；碰撞诱导解离实验条件：串联能量25 eV，碰撞时间30 ms；采用Thermo公司Xcalibur1.2软件采集并处理数据。

1.5MTT比色法考察中药提取物对Hela细胞的增殖抑制作用

取100 μL对数生长期的Hela细胞，以1×104个/孔的浓度接种到96孔培养皿中，过夜培养24 h后，分别加入80 μL阿霉素和中药提取物，使其终浓度分别为0.75、1.5、3.0 g/L，每个浓度设5个复孔(共6组平行实验)。未加药物的细胞作为对照组，培养基作为空白调零孔。分别培养24 h后，加入20 μL浓度为5 g/L MTT，继续培养4 h，舍弃上清液，每孔加入200 μL DMSO，酶标仪或者培养箱中低速振荡10 min，使结晶溶解，用酶标仪检测490 nm处吸光度A值。测定时，用空白孔调零。细胞生长抑制率=(对照组-实验组)/对照组×100%。实验重复6次，所有数据均表示为平均值±标准差 (Mean±SD)，并进行t检验分析。

1.6离心超滤质谱筛选

离心超滤质谱法主要通过比较靶分子加入前后，溶液中游离的药物成分的浓度变化来推断药物与靶分子的结合程度。加入靶分子后，游离药物的浓度降低程度越大，药物与靶分子的作用力越强。由于色谱峰积分面积与其在溶液中的浓度成正比，故可以利用色谱峰积分面积在生物靶分子加入前后的变化程度来反映其对应的化合物与生物靶分子的结合程度。假设对照组(不加靶分子)药物的色谱峰积分面积为Ac，实验组(加入靶分子)药物的色谱峰积分面积为Ae，则药物与靶分子的结合强度可表示为：Binding Degree=(Ac-Ae)/Ac。用这种计算方法对不同的复杂体系中各组分与靶分子的相对结合强度进行比较。

1.6.1离心超滤质谱筛选双链DNA结合剂

用50 mmol/L醋酸铵溶液将DNA储备液和长春花提取物储备液分别稀释为25 μmol/L和5 g/L。实验组为稀释的DNA靶分子溶液与长春花提取物溶液，按照体积比4∶1混合，终体积为200 μL。将混合溶液置于25 ℃水浴中反应30 min后，吸取180 μL至超滤管中，以13 000 r/min离心30 min。然后向滤膜上方加入150 μL 50 mmol/L醋酸铵洗脱溶液，以13 000 r/min离心30 min，重复3次，收集洗脱液，冷冻干燥。冻干后的样品用60 μL甲醇-水溶液(1∶1，V/V)充分溶解，待LC-MS/MS分析。对照组不加DNA靶分子，其他溶液条件和处理方法与实验组相同。

1.6.2离心超滤质谱筛选钙调蛋白结合剂

用含10 mmol/L Ca2+的50 mmol/L醋酸铵溶液将长春花提取物储备液稀释为5 g/L。实验组为Ca2+·CaM复合物溶液与长春花提取物稀释溶液，按照体积比4∶1混合，终体积为200 μL。将混合溶液置于25 ℃水浴中反应 20 min后，吸取100 μL至超滤管中，以13 500 r/min离心30 min。然后向滤膜上方加入100 μL含10 mmol/L Ca2+的50 mmol/L醋酸铵洗脱溶液，以13 500 r/min离心30 min，重复3次，收集洗脱液，冷冻干燥。冻干后的样品用40 μL甲醇-水溶液(1∶1，V/V)充分溶解，待LC-MS/MS分析。对照组不加Ca2+·CaM复合物，其他溶液条件和处理方法与实验组相同。

2 结果与讨论

2.1中药提取物对Hela细胞增殖的抑制作用

分别将长春花、延胡索、三尖杉、喜树果、黄连和刺五加等6种中药提取物在0.75、1.5和3.0 g/L浓度下对Hela细胞作用24 h。结果表明，均对Hela细胞增殖有不同程度的抑制作用。其中，长春花提取物对Hela细胞增殖的抑制活性最强，浓度为3.0 g/L时的抑制率为45%，与阳性对照药阿霉素接近(3.0 g/L时的抑制率为48.8%)，且抑制活性与给药浓度呈正相关；延胡索提取物在3个不同浓度下也可以显著抑制Hela细胞的增殖；三尖杉、黄连和喜树果提取物在高浓度时能够显著抑制Hela细胞的增殖；而刺五加提取物则没有明显地抑制作用，结果示于图1。

2.2长春花提取物中双链DNA结合剂的离心超滤质谱筛选

2.2.1离心超滤质谱筛选 长春花提取物与目标DNA反应，用离心超滤方法将与双链DNA结合的药物和未结合的药物分离，分别进行LC/MSn分析。长春花提取物与双链DNA作用后的和不加双链DNA对照组的液相色谱图示于图2。当提取物中的成分与双链DNA发生特异性结合后，对应化合物的峰面积将小于其对照组。结果表明，共检测到2种化合物可以与双链DNA结合，结合率分别为40.38%和47.73%。

紫外吸收数据显示，这2种化合物具有类似的紫外吸收峰，即均在247 nm和306 nm有最大紫外吸收，说明这2种化合物可能具有相似的母核结构。

注：*代表P<0.05 vs对照组，**代表P<0.01 vs对照组图1 6种中药提取物在3种浓度下对Hela细胞增殖的抑制率 (Mean±SD,n=6)Fig.1 Inhibition rates of 6 kinds of Chinese herbal extracts on Hela cell proliferation at three different concentrations (Mean±SD, n=6)

图2 长春花提取物经过双链DNA结合剂筛选之后的液相色谱图Fig.2 Ultrafiltration HPLC chromatogram of the extracts from Catharanthus roseus

2.2.2活性成分的LC/MSn鉴定 在电喷雾质谱正离子扫描模式下，化合物1的全扫描质谱图、m/z349二级串联质谱图、m/z317和m/z263三级串联质谱图示于图3。化合物1和 2的准分子离子均为m/z349，由此判断，这2个化合物互为同分异构体，且根据其相对分子质量信息，并结合文献报道，初步判定它们可能分别为蛇根碱和鸡骨常山碱[11]。为了确认其结构，分别对这2个化合物进行了串联质谱研究。结果显示，它们具有相同的碎裂规律。m/z349离子在串联质谱中得到的主要碎片离子为m/z317和m/z263，即准分子离子峰丢失质量数为32 u(CH4O)和86 u(C4H6O2)的碎片。继续对碎片离子m/z317和m/z263进行串联质谱分析，m/z317离子碎裂主要产生m/z289、263、271、247等碎片离子。m/z263离子碎裂主要产生m/z261、235、205等碎片离子。根据串联质谱分析，推测化合物1和2分别为蛇根碱和鸡骨常山碱。据文献报道，蛇根碱和鸡骨常山碱在液相色谱中难以分离，且相比之下，蛇根碱的出峰时间较早。因此，化合物1可能为蛇根碱，化合物2可能为鸡骨常山碱[13]。化合物1可能的质谱裂解途径示于图4。

图3 化合物1的全扫描质谱图(a)、m/z 349二级串联质谱图(b)、m/z 317(c)和m/z 263(d)三级串联质谱图Fig.3 Full mass spectrum of compound 1 (a), MS2 spectrum of m/z 349 (b), MS3 spectrum of m/z 317 (c) and m/z 263 (d)

图4 化合物1可能的质谱裂解途径Fig.4 Fragmentation pathways of compound 1

2.3长春花提取物中钙调蛋白结合剂的离心超滤质谱筛选

2.3.1离心超滤质谱筛选 利用离心超滤质谱技术考察长春花提取物中各组分与蛋白靶分子之间的相互作用。提取物与钙调蛋白作用后和不加钙调蛋白对照组的液相色谱图示于图5。当提取物中的成分与靶分子发生特异性结合后，对应的化合物峰面积将小于对照组。结果表明，共检测到6种化合物可以与钙调蛋白结合，其结合率分别为32.32%、34.41%、17.95%、3.13%、20.04%和46.00%。

2.3.2活性成分的LC/MSn鉴定 在电喷雾质谱正离子扫描模式下，这6种化合物按照出峰顺序对应的准分子离子峰分别为m/z349、349、337、810、825和823。为确定化合物结构，对其进行了串联质谱分析，结果列于表1。

化合物1和2的鉴定参照2.2.2节。化合物3在串联质谱中丢失32 u和60 u产生m/z305(100%)和m/z277特征碎片离子，分别对应丢失中性分子CH3OH和HCO2CH3。通过文献检索，这与它波宁的串联质谱规律是一致的，因而推测该化合物可能为它波宁[14]。

在电喷雾正离子扫描模式下，化合物4、5和6的准分子离子峰均为[M+H]+和[M+K]+离子。串联质谱中均存在丢失最小分子质量18 u的碎片离子，即丢失1分子的H2O，说明它们均含有-OH基团。同时，其丢失60 u产生的碎片离子丰度最高，即丢失HCO2CH3，对应的碎片离子分别为m/z749、765、763，说明它们均含有-OCOCH3基团。最为重要的是，化合物4、5和6在串联质谱中均存在开环碎裂(碎片离子分别为m/z540、556、554)和丢失一分子吲哚生物碱(碎片离子分别为m/z353、355、367)的特征碎片离子，示于图6。这种特征碎片离子与其母核结构和取代基密切相关。由串联质谱规律可知，这3个化合物有类似的母核结构，其差别在于取代基。通过查阅文献，推测化合物4、5和6分别为环氧长春碱、长春新碱和21’-氧代环氧长春碱[14]。

图5 长春花提取物经过钙调蛋白结合剂筛选之后的液相色谱图Fig.5 Ultrafiltration HPLC chromatograms of the extracts from Catharanthus roseus

表1 长春花提取物中钙调蛋白结合剂的质谱信息Table 1 Mass spectrometry information of calmodulin binders screened from Catharanthus Roseus extract

图6 化合物4 (a), 5 (b)和6 (c)的二级串联质谱图及特征离子碎裂途径Fig.6 MS2 spectrum and fragmentation pathways of compound 4 (a), 5 (b) and 6 (c)

3 结论

本研究基于MTT比色法，采用Hela细胞增殖抑制模型，并结合离心超滤质谱方法，建立了中药抗癌药物的筛选及其活性成分鉴定方法。结果显示，在筛选的6种中药提取物中，长春花提取物抑制Hela细胞增殖的活性最强。利用离心超滤质谱方法对长春花提取物中的抗癌活性成分进行进一步筛选和鉴定，结果表明，长春花中含量较高的2种成分——蛇根碱和鸡骨常山碱与存活素基因启动子片段和钙调蛋白均有较强的作用。该结果有助于探讨长春花提取物的抗癌活性成分及可能的作用机制。本研究方法的建立，不仅可以对中药资源库中具有抗癌活性的中药进行快速筛选，并且有助于发现其中主要的活性成分和可能的作用机制，为中药抗癌药物的筛选提供了一种简便、快速的方法。

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InvitroScreeningofAnti-CancerAgentsfromTraditionalChineseMedicineUsingtheHelaCellProliferationInhibitionModelCoupledwithCentrifugalUltrafiltrationMassSpectrometry

WEI Zhong-bao1, MA Lei2, LIU Shu2, LIU Zhi-qiang2, SHI Yi3, QU Xiao-bo1

(1.ChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun130117,China; 2.ChangchunInstituteofAppliedChemistry,ChineseAcademyofSciences,Changchun130022,China; 3.SchoolofPharmaceuticalSciences,JilinUniversity,Changchun130021,China)

The Traditional Chinese medicine (TCM) has the characteristics of abundant resources, mild effect, and good anti-cancer effect, so research and development of anti-cancer drugs from TCM has become a hot spot. However, because the TCM extract has complex components and the pharmacological effects of TCM are usually a result of the cooperation of the multiple bioactive components binding to different biological targets, it was difficult to clarify the mechanism and foundation of the bioactivities of TCM. In this study, the Hela cell proliferation inhibition model coupled with centrifugal ultrafiltration mass spectrometry was established to screen the anti-cancer agents from TCM. Firstly, the antiproliferative effect of TCM extracts on the Hela cell lines was investigated by the MTT colorimetric method. And then, the promoter DNA of survivin gene and the protein calmodulin were selected as the cancer-related biological targets and the centrifugal ultrafiltration mass spectrometry method was used to screen and identify active components acting on the selected targets from strongest active extracts. The results showed thatCatharanthusRoseusextract had the strongest inhibitory activity on Hela cell proliferation and the inhibitory activity was positively correlated to the concentration.RhizomaCorydalisextract also had significant inhibitory activity on Hela cell proliferation at three different concentrations.FoliumetRamulusCephalotaxi,RhizomaPicrorhizaeandFructusCamptothecaeAcuminataeextracts could significantly inhibit the Hela cell proliferation at high concentrations, whileAcanthopanaxSenticosusextract had no significant inhibitory effect on the Hela cell proliferation. Two binders of promoter DNA of survivin gene were screened fromCatharanthusRoseusextract by centrifugal ultrafiltration mass spectrometry, and they were identified as serpentine and alstonine by multiple tandem mass spectrometry. Six binders of protein calmodulin were screened fromCatharanthusRoseusextract and identified as serpentine, alstonine, tabersonine, leurosine, vincristine and 21’-oxo-leurosine. This study demonstrated the promising application of centrifugal ultrafiltration mass spectrometry in the screening of active components from TCM. The results could not only provide scientific references to the mechanism of the anti-cancer effects of the chemical components or the TCM extracts but also provide a rapid, sensitive and powerful platform for screening the bioactive components from TCM by using centrifugal ultrafiltration mass spectrometry.

centrifugal ultrafiltration mass spectrometry; Hela cell lines; traditional Chinese medicine; screen; anti-cancer

2017-01-05;

2017-02-17

国家自然科学基金面上项目(21073178)；吉林省科技发展计划项目——自然科学基金项目(20150101077JC)资助

魏忠宝(1978—)，男(汉族)，吉林敦化人，博士研究生，中药学专业。E-mail: 781639055@qq.com

曲晓波(1955—)，女(汉族)，吉林人，教授，从事中药学研究。E-mail: quxiaobo0504@hotmail.com

O657.63

：A

：1004-2997(2017)04-0494-09

10.7538/zpxb.2017.0006