基于高分辨质谱技术的整体动物体内药物成像分析新方法研究

罗志刚，贺玖明，李铁钢，周 帜，黄罗娇，张瑞萍，马双刚，庾石山，再帕尔·阿不力孜,2

(1.中国医学科学院北京协和医学院药物研究所，天然药物活性物质与功能国家重点实验室，北京 100050；2.中央民族大学生物成像与系统生物学研究中心，北京 100081)

基于高分辨质谱技术的整体动物体内药物成像分析新方法研究

罗志刚1，贺玖明1，李铁钢1，周 帜1，黄罗娇1，张瑞萍1，马双刚1，庾石山1，再帕尔·阿不力孜1,2

(1.中国医学科学院北京协和医学院药物研究所，天然药物活性物质与功能国家重点实验室，北京 100050；2.中央民族大学生物成像与系统生物学研究中心，北京 100081)

质谱分子成像技术作为体内药物分析的新兴工具受到越来越多的关注，其中生物体内复杂基质的干扰是面临的关键问题之一。本研究利用高分辨质谱技术的优势，采用空气动力辅助离子化质谱成像方法(AFAI-MSI)，建立了高特异性的整体动物体内药物成像分析新方法，以提高体内药物成像分析结果的准确性和可靠性。以候选新药右旋娃儿藤宁碱(S-(+)-deoxytylophorinidine, CAT)为研究对象，采用高分辨质谱全扫描与靶向扫描相结合的方式，对整体动物体内药物的分布进行AFAI-MSI分析。结果表明，该方法能够准确地反映药物特异性分布和处置情况。通过一次质谱成像实验，从整体动物水平同时实现了候选新药体内分布和药物干预下内源性代谢物的成像分析，为候选新药的早期研发提供思路与手段。

质谱成像；空气动力辅助离子化(AFAI)；药物分析；代谢产物；内源性代谢物

药物在整体动物水平的吸收、分布、代谢及排泄情况的研究是新药研发的重要内容。获取药物对生物体内源性物质的干预和调控作用信息，对于药物的药效、作用机制及毒理的阐释具有重要意义。分子成像技术是实现这一目标的最直观分析方法[1-3]，现有的成像技术主要有放射自显影、荧光成像和质谱成像等。其中，放射自显影和荧光成像技术虽然灵敏度高，但需要特异性标记[4-5]，且不能区分药物和代谢产物；质谱成像技术(MSI)无需特异性标记，能够同时进行多分子检测和分析，且对药物及其代谢产物具有很好的区分和选择性[6-10]。但该方法仍面临一些技术上的挑战，例如，由于药物及其代谢产物在动物体内分布差异大、含量低、易受动物体内复杂基质的影响，因此需要高分辨、高特异性的质谱成像技术与方法，以提高获得信息的准确性和可靠性[11-12]。

通常，传统的药物成像分析只关注药物本身，忽略了其对内源性代谢物的影响。最新的系统生物学观点认为，考察内源性物质的变化对药物代谢特性的影响是成功预测药物吸收、分布、代谢、排泄性质以及毒性评价的前提[13]。综合考察药物、代谢物和内源性代谢物的时空动态变化，有助于更深入地了解药物的体内过程和变化规律，为其作用机制、药效及毒性的预测与评价提供依据。

近年来，HE等采用自主研制的新型常压敞开式空气动力辅助离子化(AFAI或AFADESI)技术及其装置[14-15]，探索并创建了整体动物体内药物成像分析的AFAI-MSI方法[8,16]，获得了抗肿瘤候选新药右旋娃儿藤宁碱(S-(+)-deoxytylophorinidine, CAT)及其主要代谢物在整体动物体内的动态分布情况[8]。本工作将在前期研究的基础上，拟采用Q-Orbitrap高分辨质谱AFAI-MSI技术，建立全扫描与靶向扫描相结合的质谱成像分析方法，在整体动物水平同时考察抗肿瘤候选新药(CAT)分布和内源性代谢物在药物干预下的成像分析，旨在建立候选药物体内整体分析及原位表征新方法。希望为新药研发早期阶段，揭示药物体内作用部位和过程的研究提供思路与手段。

1 实验部分

1.1仪器与装置

AFAI离子源接口：与Q-Orbitrap质谱仪相

兼容；离子传输管：长度500 mm，外径4 mm，内径3 mm；气体流量计(0～45 L/min)：天津流量仪表有限公司产品；高压电源(-10 000～10 000 V)：东文高压电源股份有限公司产品；MTS225三维电控平移台：北京光学仪器厂产品；SC100步进电机控制器：北京北光世纪仪器有限公司产品；LSP01-2A Longer Pump注射泵：保定兰格恒流泵有限公司产品；CM 3600冷冻切片机：德国莱卡公司产品；MRS-2400A48U Microtech扫描仪：上海中晶科技有限公司产品。

1.2材料与试剂

1.2.1试剂 甲醇：色谱纯，德国Merck公司产品；甲酸：色谱纯，美国Dikma Technologies 公司产品；实验用水：娃哈哈纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司产品；生理盐水：吉林科伦康乃尔制药有限公司产品；干冰：北京龙洁斯经贸有限公司产品。

1.2.2实验动物 3只健康雄性SPF级SD大鼠(许可证号：SCXK(京)2012-0001)：购于中国医学科学院医学实验动物研究所。大鼠体重为160～170 g，分别用于空白、给药30 min和2 h后药物分布的质谱成像分析。

1.2.3样品 CAT样品：由中国医学科学院药物研究所庾石山教授课题组提供。CAT及其主要代谢物M1的结构式示于图1。

1.3实验过程

1.3.1整体大鼠组织切片的制备 采用尾静脉注射，以10 mg/kg剂量分别在给药CAT 30 min和2 h后，使用超剂量乙醚将大鼠麻醉处死；右侧卧固定于冷冻模具中，倒入冷冻液，于-80 ℃冷冻保存。进行冷冻切片前，移入-20 ℃冰箱中，放置过夜。采用冷冻切片机切出厚度为40 μm的整体切片，尽可能包含主要器官，用相同的方法对空白对照的大鼠进行切片。质谱成像实验前，将切片在真空干燥器中干燥30 min。

图1 CAT和M1的结构式Fig.1 Chemical structures of CAT and M1

1.3.2整体大鼠质谱成像数据的采集 采用与Q-Orbitrap质谱仪相兼容的AFAI-MSI系统，设定喷雾电压4 000 V，喷雾气压力0.8 MPa，传输管电压1 200 V，毛细管温度450 ℃。样品解析系统参数与前期研究基本保持一致[8]，喷雾溶剂为甲醇-水溶液(80∶20，V∶V，含0.1%甲酸)，流速10 μL/min。电喷雾针与样品表面的角度为60°，喷嘴与样品间的距离为0.7 mm，喷嘴与传输管入口间的距离为3 mm，质谱采集锥与传输管出口间的距离为20 mm，抽气流速为45 L/min。样品沿X轴方向移动速度为0.4 mm/s，相邻两个扫描行之间的步进间隔为0.5 mm。分别采用正离子模式的全扫描(m/z100～1 000)和2个二级质谱扫描(母离子分别为m/z364和350，母离子的选择宽度为2 u)进行数据采集，全扫描质量分辨率为70 000，二级质谱扫描分辨率为17 500，谱图采集频率约为2.5 Hz。

2 结果与讨论

2.1高分辨全扫描与靶向扫描的质谱成像分析

AFAI-MSI成像平台系统参数与前期实验一致[8,16]，对给药CAT 2 h和空白对照的大鼠整体组织切片进行全扫描(m/z100～1 000)和二级质谱扫描，AFAI-MS谱图及成像结果示于图2。从图2a中可以看出，质谱峰信号复杂，背景离子强度高，药物和代谢产物的离子峰较弱。但从区域放大图(图2b、2c)中可以观察到离子峰m/z364.190 5和m/z350.175 1，它们与背景离子或内源性代谢物离子得到良好区分。对m/z364.190 5和m/z350.175 1进行成像分析，结果示于图2d～2g。对比质量容差为±0.005(质量分辨率=350/0.005=70 000，图2d、2e)和±0.02(质量分辨率=350/0.02=17 500，图2f、2g)的成像图可以发现：在高分辨的图2d中可以观察到药物CAT的分布轮廓特征；在低分辨的图2f中可观察到内源性代谢物或背景离子对药物成像的干扰，这给药物成像结果的判断带来困难。

采用AFAI-MS/MS扫描模式对组织切片中的药物(m/z364)和代谢产物(m/z350)进行成像数据获取和分析，结果示于图2h～2k。从图2h和2i中可以观察到碎片离子m/z70，质谱信号具有很好的特异性，证明是CAT及其代谢产物的特征子离子。在m/z(70.065 8±0.005)质谱图上，可清楚地观察到药物和代谢产物的分布轮廓，这与高分辨全扫描成像结果一致。上述结果表明，利用Q-Orbitrap质谱仪的高分辨分析能力，采用全扫描与二级质谱扫描相结合的方式，在内源性代谢物干扰的情况下，可实现药物及其主要代谢产物同时、准确地质谱成像分析。

2.2药物CAT干预下内源性代谢物的时空动态变化

在上述研究基础上，采用质谱全扫描方式对候选新药CAT及其代谢产物M1，在不同给药时间和空白大鼠体内的分布情况进行AFAI-MSI分析，结果示于图3。质谱成像图显示了清晰的器官轮廓，与光学图片中相应器官的轮廓匹配良好；另外，成像图显示了CAT在不同器官分布的含量差异，与MS/MS谱扫描获得的成像图一致。从质谱成像图中可以观察到：CAT在胃肠区的分布含量最高；在脑、脊髓、肾、肾上腺及胰腺中均有较高的含量分布；在肺中分布较少，在心脏和肝中分布最少。对比不同给药时间的成像图可获得以下信息：给药2 h后，CAT在脑、肾上腺及肾脏中均可稳定存在，在心、肝、肺部位分布较少；CAT及其主要代谢产物M1在胃和肠部位蓄积和排泄。该成像结果与本课题组前期多反应监测(MRM)分析结果一致[8]。上述结果证明，高分辨与全扫描模式结合的AFAI-MSI方法能够高灵敏度、高特异性地检测药物及其代谢产物，且能反映药物在整体动物中的分布情况。

采用AFAI-MSI成像技术，利用高分辨质谱全扫描方式，不仅可对药物及其代谢产物进行分析，同时可获得大量内源性代谢物的信息。CAT、代谢产物和代表性内源性代谢物在整体动物体内的分布情况示于图4。该图分别显示了 CAT药物([M+H]+,m/z364.190 4)及其代谢产物([M+H]+,m/z350.173 5)和代表性内源性代谢物中胆碱(m/z104.107 1)，氨基酸类(m/z121.064 5、122.071 6、148.133 3)，脂类(m/z754.532 5、796.525 8、798.541 0、848.556 2)等分子的分布情况。其中，氨基酸类主要分布在胃肠区域；酯类m/z754.532 5主要分布在肺中，m/z798.541 0分布在脑和脊髓等中枢神经系统中；胆碱在大鼠体内的分布情况随给药时间的延长而发生显著变化，在空白大鼠切片组织中，胆碱主要分布在胃肠的腔壁组织和大脑中，给药30 min 和2 h的大鼠切片组织中，胆碱与CAT的分布特点一致，在皮层和胃肠腔随药物的分布变化其含量显著提高。由此认为，胆碱的分布变化可能与CAT的调控作用或药效、毒性作用有关。

注：a.给药CAT 2 h后大鼠组织切片AFAI-MS全扫描质谱图；a′.空白大鼠组织切片AFAI-MS全扫描质谱图;b.图a中m/z 364处的放大质谱图；b′.图a′中m/z 364处的放大质谱图；c.图a中m/z 350处的放大质谱图；c′.图a′中m/z 350处的放大质谱图；d.提取离子m/z 364.190 5在±0.005容差范围内的全扫描质谱像图；e.提取离子m/z 350.175 1在±0.005容差范围内的全扫描质谱像图；f.提取离子m/z 364.190 5在±0.02容差范围内的全扫描质谱像图；g.提取离子m/z 350.175 1在±0.02容差范围内的全扫描质谱像图；h.m/z 364的子离子AFAI-MS/MS质谱图；i.m/z 350的子离子AFAI-MS/MS质谱图；j.提取离子m/z 70.065 8在±0.005容差范围内的子离子扫描(m/z 364)质谱像图；k.提取离子m/z 70.065 8在±0.005容差范围内的子离子扫描(m/z 350)质谱像图图2 AFAI-MSI分析给药CAT 2 h后大鼠体内药物分布的质谱成像数据和结果Fig.2 Imaging data and results obtained by AFAI-MSI analysis from whole-body rat tissue section after dosing for 2 h

图3 AFAI-HRMS 和 MS/MS方法分析CAT (m/z 364)及其主要代谢产物M1 (m/z 350)在整体动物体内的分布特征Fig.3 Distribution characteristics of CAT (m/z 364) and its metabolite M1 (m/z 350) in the whole body tissue section by AFAI-HRMS and MS/MS

上述结果表明，该方法可实现动物体内不同种类内源性代谢物的同时成像分析。基于高分辨质谱的AFAI-MSI方法在不需预先了解化合物结构信息的情况下，通过对质谱数据的分析，可获取未知内源性代谢物在器官组织中的分布信息，可以为代谢物的结构确认提供信息。

3 结论

针对药物及其代谢物的高灵敏、高分辨的检测需求，本研究采用高分辨质谱AFAI-MSI成像技术，建立了一种整体动物体内药物成像分析和原位表征的新方法。该方法能够获取药物及其代谢产物在整体动物体内的分布信息，同时可获取大量未知内源性代谢物在药物干预下的分布信息。利用高分辨质谱全扫描模式，只需一次质谱成像分析，即可实现在整体动物水平上同时考察候选新药和内源性代谢物在药物干预下的空间动态变化。这有助于更深入地了解药物的体内过程和变化规律，为其作用机制、药效及毒性的预测与评价提供依据，同时有望为候选新药的早期研发、揭示药物体内作用部位及过程等提供研究思路与手段。

致谢：感谢清华大学唐飞教授和王晓浩教授课题组在质谱成像装置硬件开发上的帮助；感谢科迈恩(北京)科技有限公司田润涛博士在质谱成像软件开发上的支持；感谢中国医学科学院医学实验动物研究所黄澜老师在整体动物切片制作过程中给予的帮助。

图4 AFAI-MSI全扫描模式分析CAT(m/z 364) 、代谢产物M1(m/z 350) 和代表性内源性代谢物(m/z 104, m/z 121等) 在整体动物体内的分布特征Fig.4 Distribution characteristics of CAT (m/z 364), its metabolites (m/z 350) and endogenous metabolites (m/z 104, 121, et al) in whole-body rat tissue section acquired by AFAI-MSI in full mass scan mode

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DevelopmentofaNovelImagingMethodforWhole-BodyAnimalBiopharmaceuticalAnalysisUsingHighResolutionMassSpectrometryTechnique

LUO Zhi-gang1, HE Jiu-ming1, LI Tie-gang1, ZHOU Zhi1, HUANG Luo-jiao1,
ZHANG Rui-ping1, MA Shuang-gang1, YU Shi-shan1, ABLIZ Zeper1,2

(1.StateKeyLaboratoryofBioactiveSubstanceandFunctionofNaturalMedicines,InstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China; 2.CenterforImagingandSystemsBiology,MinzuUniversityofChina,Beijing100081,China)

Mass spectrometry imaging (MSI) is a label-free molecular imaging technique whereby to simultaneously measure and map multiple biomolecules directly from tissue sections. It is reported that MSI analysis of metabolites has undergone a fast development and has been developed into a powerful tool for drug development and discovery in recent years. However, some problems, such as molecule covering range, sensitivity of metabolite detection, and the interference from the complicated biological matrix are still remaining as challenges for current MSI technologies. To tackle with these problems, our group previously developed an air flow assisted ionization (AFAI) MSI platform, and successfully applied it oninvivopharmaceutical analysis. Aiming at increasing the sensitivity and specificity ofinvivopharmaceutical analysis, an integrated MSI method to simultaneously image drug and endogenous metabolites in whole body tissue section was developed using AFAI-MSI in a full mass scan mode. This method can acquire not only the distribution of drugs and its metabolites, but also enormous various endogenous metabolites in one experiment, as resulted to obtaininsituspatial and chemical information of parent drugs and metabolites in whole-body tissue sections; and the target organs of drugs can be directly mapped. Based on our previously reported AFAI ion source, we modified the interface to couple the AFAI ion source on a Q-orbitrap mass spectrometer, and constructed an new AFAI-MSI device, and further specifically programed the data features (high resolution MS data) into our MSI software, finally achieved rapid and reliable MSI analysis of tissue section, along with high stability and accuracy information for metabolite identification. The drug candidateS-(+)-deoxytylophorinidine (CAT) was selected to study the spatial distribution in rat. AFAI-MSI analysis was performed for the administered tissue sections along with the data acquiring in high mass resolution full scan mode and targeted selected ion scan mode, and the distribution and dispersion of CAT in rat euthanized at different time points (30 min and 2 h) were acquired accurately and specially. By integrating the advantage of air flow-assisted ionization (AFAI) and high resolution mass spectrometry imaging (HRMSI), a high specified MSI method has been developed to improve accuracy and reliability for the simultaneous mapping drug and endogenous metabolites in whole-body rat tissue section. The acquired information of the endogenous metabolites lay a foundation to disclose the relevance of the biological transformation pattern and distribution characteristic with the effect and toxicity of new drugs, thus providing critical basis for the early prediction of drug effect and toxicity. The study demonstrated that the simultaneous imaging drug and the endogenous metabolites can be realized by high mass resolution AFAI-MSI analysis in a single experiment, which will provide an alternative way for the earlier drug discovery.

mass spectrometry imaging; air flow assisted ionization; pharmaceutical analysis; drug metabolites; endogenous metabolites

国家自然科学基金项目(81373370，21335007)，重大科学仪器设备开发专项(2016YFF0100304)资助

罗志刚(1976—)，男(汉族)，河北安新人，助理研究员，从事药物分析研究。E-mail: luozhg@imm.ac.cn

再帕尔·阿不力孜(1961—)，男(维吾尔族)，新疆乌鲁木齐人，研究员，从事药物分析研究。E-mail: zeper@imm.ac.cn

O657.63

：A

：1004-2997(2017)04-0417-08

10.7538/zpxb.2017.0036