LC/MS用于匹多莫德有关物质结构鉴定

周瑞琪，刘 洁，刘 辉，杭太俊

(1.中国药科大学药物分析教研室，江苏 南京 210009；2.海南省食品药品检验所，海南 海口 570100)

LC/MS用于匹多莫德有关物质结构鉴定

周瑞琪1，刘 洁2，刘 辉2，杭太俊1

(1.中国药科大学药物分析教研室，江苏 南京 210009；2.海南省食品药品检验所，海南 海口 570100)

采用液相色谱-质谱(LC/MS)技术鉴定匹多莫德的有关物质，选取Sepax GP-C8色谱柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，以甲醇-三氟乙酸溶液为流动相，梯度洗脱，对匹多莫德有关物质进行分离；采用电喷雾正离子化-高分辨飞行时间质谱法(ESI-TOF MS)测定各有关物质离子的准确质量和元素组成，三重四极杆串联质谱(ESI-MS/MS)测定子离子特征。结果表明：在所建立的条件下，匹多莫德及其有关物质的分离良好，检测并鉴定出11个主要有关物质。该技术能有效地分离鉴定匹多莫德中的有关物质，其鉴定结果可为质量控制和工艺优化提供参考。

匹多莫德；有关物质；降解产物；结构鉴定；液相色谱-质谱(LC/MS)

图1 匹多莫德的化学结构Fig.1 Chemical structure of pidotimod

匹多莫德(pidotimod,(R)-3-[(S)-(5-氧代-2-吡咯烷基)羰基]-四氢噻唑-4-羧酸)是一种化学合成的口服免疫促进剂，其化学结构类似于二肽，示于图1。20世纪80年代后期，该化合物由意大利Poli化学公司成功合成，并于1993年获准上市应用于临床，目前上市剂型有片剂、胶囊、口服溶液和散剂等[1]。它既可以促进非特异性免疫反应，又可以促进特异性免疫反应，具有显著的抗病毒、抗感染、抗氧化和抗刺激等作用[2-4]。匹多莫德可以用于多种疾病的辅助治疗，比如，临床上常用于呼吸道疾病的预防及治疗[5-9]，及细菌感染、病毒感染和复发性口疮、白癜风、过敏性紫癜等与免疫功能失衡的有关疾病的治疗[3,10-11]。

关于匹多莫德的质量研究和生物样本分析已有文献报道[12-19]，其中涉及到的液相色谱-质谱(LC/MS)方法的建立尚不完善。该方法多在流动相中添加甲酸和乙酸等存在末端吸收的成分[12-16]，对匹多莫德及其有关物质的紫外吸收干扰较大，目前仍未有完善的LC/MS方法对匹多莫德有关物质进行分析鉴定。有关物质检测方法的液相条件多在流动相中添加磷酸和磷酸盐等非挥发性物质[17-19]，不适用于LC/MS检测。

本工作拟建立适用于匹多莫德有关物质检查的LC/MS方法，通过飞行时间质谱(TOF MS)和三重四极杆串联质谱(MS/MS)分别测定有关物质的准确质量和二级质谱，并且通过与对照品比对、二级质谱裂解解析、合成工艺分析，推测它们的结构，希望为匹多莫德的生产工艺和质量控制提供方法参考和依据。

1 实验部分

1.1主要仪器与装置

1290 Infinity 液相色谱-6224飞行时间质谱仪：美国Agilent公司产品，配有二极管阵列检测器、电喷雾离子源和MassHunter工作站；TSQ Quantum Ultra AM型MS/MS联用仪：美国Thermo公司产品，配有电喷雾离子源和Xcalibur3.0数据处理系统。

1.2试药与试剂

匹多莫德原料药(批号：04.1015-160613)：浙江仙琚制药股份有限公司产品；杂质A、B对照品：江苏吴中医药集团有限公司苏州制药厂产品；三氟乙酸：纯度99%，萨恩化学技术有限公司产品；甲醇：色谱纯，美国Tedia公司产品；去离子水：杭州娃哈哈公司产品。

1.3实验条件

1.3.1色谱条件 色谱柱为Sepax GP-C8(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流动相：A为0.005%三氟乙酸溶液， B为甲醇；线性梯度洗脱：0 min(95%A)→20 min(95%A)→35 min(90%A)→36 min(95%A)→40 min(95%A)；流速1 mL/min；柱温30 ℃；进样量20 μL；检测波长210 nm。

1.3.3MS/MS质谱条件 三重四极杆质谱电喷雾离子源,正离子检测模式；喷雾电压3.5 kV；鞘气(N2)压力310 kPa；辅助气(N2)压力10 kPa；毛细管温度350 ℃；碰撞气(Ar)0.20 Pa；碰撞能量10～30 eV。

1.4样品制备

1.4.1供试品溶液的制备 精密称定10 mg匹多莫德原料药，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇-水溶液(5∶95，V/V)溶解样品并稀释至刻度，摇匀即得供试品溶液。精密量取适量上述溶液，加溶样液定量稀释，分别制成1%和0.1%的自身对照溶液。

1.4.2对照品溶液的制备 取适量各对照品，分别精密称定，加溶样液溶解并定量稀释成1 g/L样品；各取1 mL对照品溶液和碱破坏样品，混合均匀，即得混合对照品溶液。

1.4.3强制降解实验溶液的制备 强制降解条件如下：酸破坏(1 mL 4 mol/L HCl，室温，3 h)，碱破坏(1 mL 1 mol/L NaOH，室温，2 h)，氧化破坏(1 mL 3%H2O2，室温，5 min)，热破坏(2 mL 溶样液，90 ℃水浴，5 h)和光照破坏(4 500 lx±500 lx，15 d)。酸破坏和碱破坏在稀释前使用相应的NaOH溶液和HCl溶液中和，所有破坏样最终使用溶样液稀释成约含1 g/L的强制降解实验溶液。

2 结果与讨论

2.1有关物质检测

本实验采用HPLC法分析匹多莫德有关物质，在优化的色谱条件下，匹多莫德原料药及强制降解实验供试溶液的各有关物质均得到良好分离，测得的各有关物质保留时间从小到大依次编号，其色谱图示于图2。图2a显示原料药中杂质含量较少，采用自身0.1%对照法估算有关物质含量，只有杂质9的含量大于0.1%。强制降解实验结果表明：在氧化条件下主要降解为有关物质2和3(图2b)；在高温条件下主要降解为有关物质1、4、9和11(图2c)；在强酸条件下主要降解为有关物质1、4、5、9和11(图2d)；在强碱条件下主要降解为有关物质1、4、5、8、9和11(图2e)；在光照条件下主要降解为有关物质1、2、4、6、7、9和11(图2f)。未在供试品及强制降解样品中检测到杂质对照品B(有关物质10)。

2.2有关物质结构分析

HPLC-ESI+-TOF MS测得各有关物质母离子的准确质量与离子组成，三重四极杆质谱获取二级质谱碎片信息，通过与匹多莫德及其有关物质对照品二级质谱碎片离子的对比分析，鉴定各有关物质结构，结果示于表1和图3。

ESI+-TOF MS测得匹多莫德[M+H]+离子的准确质量为245.058 3，与离子式C9H13N2O4S+相应，MS/MS主要特征碎片离子为m/z227、199、134、88、84；匹多莫德的二级碎片离子中，m/z88 碎片与有关物质10一致，来源于相同的噻唑烷结构；m/z84碎片与有关物质4一致，来自相同的吡咯烷酮结构；m/z227与[M+H]+离子中氨基与羧基缩合脱去H2O相应；m/z134为酰胺键断裂而产生的特征碎片；m/z199与[M+H]+离子中噻唑烷环脱去HCOOH相应，该离子进一步发生酰胺键断裂产生m/z84离子。匹多莫德的二级质谱分析结果示于图4，该结果对其有关物质的解析确证具有参考意义。

注：a.原料药供试品；b.氧化破坏；c.高温破坏；d.酸破坏；e.碱破坏；f.光照破坏；g.混合对照品图2 匹多莫德及其强制降解样品的高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of pidotimod and the degradation samples from stress tests

表1 匹多莫德有关物质结构的LC-TOF MS和LC-MS/MS鉴定结果Table 1 Identified results of related substances of pidotimod by LC-TOF MS and LC-MS/MS

图3 匹多莫德有关物质结构图Fig.3 Chemical structures of the related substances of pidotimod

图4 匹多莫德[M+H]+(m/z 245)离子的二级质谱图及其裂解途径Fig.4 MS/MS spectrum of pidotimod [M+H]+(m/z 245) ion and its fragmentation pathways

图5 有关物质1[M+H]+(m/z 134)离子的二级质谱图及其裂解途径Fig.5 MS/MS spectrum of related substance 1 [M+H]+(m/z 134) ion and its fragmentation pathways

有关物质1：ESI+-TOF MS测得有关物质1[M+H]+离子的准确质量为134.026 6，与离子式C4H8NO2S+相应，MS/MS主要特征碎片离子为m/z88，与噻唑烷结构相应。该有关物质在酸、碱、热和光照破坏中均有产生，为易降解产生的杂质，结合其质谱信息，鉴定为匹多莫德两个环之间酰胺键的水解产物，结果示于图5。

有关物质2：ESI+-TOF MS测得有关物质2[M+H]+离子的准确质量为261.051 1，与离子式C9H13N2O5S+相应，比匹多莫德质量数多16，与增加1个氧原子相应；MS/MS主要特征碎片离子为m/z243、225、215、197、150、132、104和84，其中m/z243、150均比匹多莫德相应的特征碎片离子m/z227和134多16，故有关物质2可能为匹多莫德的噻唑烷环生成亚砜后的产物，其质谱信息及裂解途径示于图6。

有关物质3：ESI+-TOF MS测得有关物质3[M+H]+离子的准确质量为243.040 4，与离子式C9H11N2O4S+相应，比有关物质2质量数少18，与脱去一分子H2O相应；MS/MS主要特征碎片离子为m/z225、215、197、132、104和84，均存在于有关物质2的二级碎片离子中，故推测其为有关物质2的羧基与氨基缩合产生，其质谱信息及裂解途径示于图7。

图6 有关物质2[M+H]+(m/z 261)离子的二级质谱图及其裂解途径Fig.6 MS/MS spectrum of related substance 2 [M+H]+(m/z 261) ion and its fragmentation pathways

图7 有关物质3[M+H]+(m/z 243)离子的二级质谱图及其裂解途径Fig.7 MS/MS spectrum of related substance 3 [M+H]+(m/z 243) ion and its fragmentation pathways

有关物质5：ESI+-TOF MS测得有关物质5[M+H]+离子的准确质量为263.069 4，与离子式C9H15N2O5S+相应，比匹多莫德质量数多18，与增加一分子H2O相应，MS/MS主要特征碎片离子为m/z245、227、134。该有关物质在酸、碱和高温破坏样品中均明显增加，其二级碎片离子与匹多莫德及其特征碎片一致，故推测为吡咯烷酮环上的酰胺键水解产生，其质谱信息及裂解途径示于图8。

有关物质6：ESI+-TOF MS测得有关物质6[M+H]+离子的准确质量为104.016 5，与离子式C3H6NOS+相应，MS/MS主要特征碎片离子为m/z86、60、58、45。该有关物质仅存在于光照破坏样品中，分子质量较小，且m/z104 存在于氧化破坏产生的有关物质2和3的二级碎片中，故推测为氧化产物断裂产生的小分子有关物质，其质谱信息及裂解途径示于图9。

有关物质7：ESI+-TOF MS测得有关物质7[M+H]+离子的准确质量为261.055 3，与离子式C9H13N2O5S+相应，MS/MS主要特征碎片离子为m/z215、84。该有关物质比匹多莫德质量数多16，可能为匹多莫德氧化产物，其二级碎片离子m/z84 为吡咯烷酮结构特征碎片，且无明显的噻唑烷结构碎片离子，推测其噻唑烷结构发生变化不易在二级质谱中携带正电荷，有关物质7为匹多莫德噻唑烷环的氮被氧化为氧化胺后的产物，其质谱信息及裂解途径示于图10。

图8 有关物质5[M+H]+(m/z 263)离子的二级质谱图及其裂解途径Fig.8 MS/MS spectrum of related substance 5 [M+H]+(m/z 263) ion and its fragmentation pathways

图9 有关物质6[M+H]+(m/z 104)离子的二级质谱图及其裂解途径Fig.9 MS/MS spectrum of related substance 6 [M+H]+(m/z 104) ion and its fragmentation pathways

有关物质8：ESI+-TOF MS测得有关物质8[M+H]+离子的准确质量为245.058 9，与离子式C9H13N2O4S+相应，MS/MS主要特征碎片离子为m/z227、188、134、88、84，该有关物质为碱破坏的典型产物，与匹多莫德互为同分异构体，二级碎片多数与匹多莫德一致，m/z188为其特有的碎片离子，推测为匹多莫德环合再水解产生的同分异构体，其质谱信息及裂解途径示于图11。

图10 有关物质7[M+H]+(m/z 261)离子的二级质谱图及其裂解途径Fig.10 MS/MS spectrum of related substance 7 [M+H]+(m/z 261) ion and its fragmentation pathways

图11 有关物质8[M+H]+(m/z 245)离子的二级质谱图及其裂解途径Fig.11 MS/MS spectrum of related substance 8 [M+H]+(m/z 245) ion and its fragmentation pathways

有关物质9：ESI+-TOF MS测得有关物质9[M+H]+离子的准确质量为227.048 8，与离子式C9H11N2O3S+相应，比匹多莫德质量数少18，与脱去一分子H2O相应；MS/MS主要特征碎片离子为m/z199、181、170、88、84，该有关物质在供试品和酸、碱、高温、光照样品中均被检测到，为较易产生的杂质，推测为匹多莫德分子内形成酰胺键环合产生，其质谱信息及裂解途径示于图12。

有关物质10：ESI+-TOF/MS测得有关物质10(杂质对照品)[M+H]+离子的准确质量为162.058 3，与离子式C6H12NO2S+相应；MS/MS主要特征碎片离子为m/z88，该有关物质在强制降解实验样品和供试品中均未检出，m/z88碎片离子来源于其结构中的噻唑烷环，有关物质10的二级质谱分析结果对其他有关物质的解析具有参考意义。

有关物质11：ESI+-TOF MS测得有关物质11[M+H]+离子的准确质量为245.059 0，与离子式C9H13N2O4S+相应，与匹多莫德质量数相同；MS/MS主要特征碎片离子为m/z227、199、88、84，与匹多莫德二级碎片离子相比，m/z134的二级碎片离子不明显，说明噻唑烷环相关结构发生变化，该有关物质在酸、碱、高温和光照实验中含量均明显增加，推测为匹多莫德分子内脱水缩合后异位酰胺键水解产生，其质谱信息及裂解途径示于图13。

图12 有关物质9[M+H]+(m/z 227)离子的二级质谱图及其裂解途径Fig.12 MS/MS spectrum of related substance 9 [M+H]+(m/z 227) ion and its fragmentation pathways

图13 有关物质11[M+H]+(m/z 245)离子的二级质谱图及其裂解途径Fig.13 MS/MS spectrum of related substance 11 [M+H]+(m/z 245) ion and its fragmentation pathways

3 结论

本研究建立了挥发性流动相液相色谱-质谱联用方法分析匹多莫德有关物质，匹多莫德与检出的11个主要有关物质均可得到有效分离。缓冲溶液pH值是影响色谱保留的关键因素，pH降低可以增强高极性有关物质的色谱保留，而常用的甲酸和乙酸等pH调节剂对210 nm的检测波长干扰较大。为兼顾色谱分离和紫外检测灵敏度，本研究选用0.005%三氟乙酸溶液作为水相流动相，甲醇作为有机相流动相，结合梯度洗脱的色谱方法实现了匹多莫德与11种主要有关物质的良好分离。

本实验检出并鉴定了匹多莫德的11个主要有关物质，其中2个(有关物质4、10)为已知杂质，4个(有关物质1、2、8、9)已有文献报道[17]，另外5个为未知杂质。根据杂质来源可将所有有关物质分为工艺杂质和降解杂质。有关物质1～9和11均在强制降解样品中明显增加，可归属于降解杂质；有关物质1、4和10作为起始原料或中间体参与匹多莫德的合成，故也有可能来源于合成工艺杂质。

[1] 李慧，王永军，孙进. 匹多莫德及其制剂的研究进展[J]. 中国药剂学杂志,2012,10(4):68-73.

LI Hui, WANG Yongjun, SUN Jin. Progress of pidotimod and its preparation[J], Chinese Journal of Pharmaceutics, 2012, 10(4): 68-73(in Chinese).

[2] ZUCCOTTI G V, MAMELI C. Pidotimod: the past and the present[J]. Italian Journal of Pediatrics, 2013, 39(1): 75-77.

[3] FERRARIO B E, GARUTI S, BRAIDO F, et al. Pidotimod: the state of art[J]. Clinical and Molecular Allergy, 2015, 13(1): 8-17.

[4] 田新平，曾小峰. 新型合成免疫调节剂——匹多莫德[J]. 中国新药杂志,2005,14(1):111-114.

TIAN Xinping, ZENG Xiaofeng. A new synthetic immunomodulator—pidotimod[J]. Chinese Journal of New Drugs, 2005, 14(1): 111-114(in Chinese).

[5] BOZZETTO S, PIRILLO P, CARRARO S, et al. Metabolomic profile of children with recurrent respiratory infections[J]. Pharmacological Research, 2017, 115: 162-167.

[6] MANIKAM L, REED K, VENEKAMP R P, et al. Limited evidence on the management of respiratory tract infections in down’s syndrome: a systematic review[J]. Pediatric Infectious Disease Journal, 2016, 35(10): 1 075-1 079.

[7] ESPOSITO S, GARZIANO M, RAINONE V, et al. Immunomodulatory activity of pidotimod administered with standard antibiotic therapy in children hospitalized for community-acquired pneumonia[J]. Journal of Translational Medicine, 2015, 13(1): 288-297.

[8] ZUCCOTTI G V, MAMELI C. Respiratory infections and immunostimulants in childhood: an update[J]. Journal of Pediatric and Neonatal Individualized Medicine, 2015, 4(2): e040218.

[9] NAMAZOVA-BARANOVA L S, ALEKSEEVA A A, KHARIT S M, et al. Efficacy and safety of pidotimod in the prevention of recurrent respiratory infections in children: a multicentre study[J]. International Journal of Immunopathology & Pharmacology, 2014, 27(3): 413-419.

[10]LI E, RUAN Y, QIAN C, et al. Streptococcal infection and immune response in children with Tourette’s syndrome[J]. Child’s Nervous System, 2015, 31(7): 1 157-1 163.

[11]庄俊鹏，林小燕，王璟. 匹多莫德临床应用进展[J]. 哈尔滨医药,2015,35(5):401-403.

ZHUANG Junpeng, LIN Xiaoyan, WANG Jing. Advances in clinical application of pidotimod[J]. Harbin Medical Journal, 2015, 35(5): 401-403(in Chinese).

[12]MADHURI BAGHEL, SADHANA J, RAJPUT. HPLC Separation of pidotimod enantiomers using beta-cyclodextrin based chiral stationary phase[J]. Indo American Journal of Pharmaceutical Research, 2016, 6(7): 6 182-6 189.

[13]WANG G, WANG Q, RAO T, et al. A robust LC-MS/MS method for the determination of pidotimod in different biological matrixes and its application to in vivo and in vitro pharmacokinetic studies[J]. Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical & Life Sciences, 2016, (1 023/1 024): 36-43.

[14]HUANG J H, HUANG X H, WANG K, et al. Bioequivalence evaluation of two formulations of pidotimod using a limited sampling strategy[J]. Biomedicine and Pharmacotherapy, 2013, 67(6): 475-480.

[15]LOU H G, RUAN Z R, JIANG B. Quantitative determination of pidotimod in human plasma by liquid chromatography tandem mass spectrometry: application to a bioequivalence study[J]. Arzneimittel-Forschung, 2012, 62(2): 99-104.

[16]CHEN H S, SHEN M, CHEN L Y. HILIC-MS-MS for the quantification of pidotimod in human plasma[J]. Chromatographia, 2011, 73(7): 767-773.

[17]毛柯，徐斌，孔蓉，等. 匹多莫德口服液中有关物质的HPLC法测定[J]. 中国医药工业杂志,2016,47(12):1 568-1 572.

MAO Ke, XU Bin, KONG Rong, et al. Determination of related substances of pidotimod oral solution by HPLC[J]. Chinese Journal of Pharmaceuticals, 2016, 47(12): 1 568-1 572(in Chinese).

[18]王建,张翼,李毓,等. 高效液相色谱法测定匹多莫德片的含量及有关物质[J]. 西南大学学报:自然科学版,2015,37(12):178-184.

WANG Jian, ZHANG Yi, LI Yu, et al. Determination of the contents of pidotimod and its related substances in the tablet products by HPLC[J]. Journal of Southwest University: Natural Science Edition, 2015, 37(12): 178-184(in Chinese).

[19]方克忠,范锋,于治国. HPLC法测定匹多莫德中的有关物质[J]. 沈阳药科大学学报,2014,31(10):772-777.

FANG Kezhong, FAN Feng, YU Zhiguo. Determination of pidotimod and its related substances by HPLC[J]. Journal of Shenyang Pharmaceutical University, 2014, 31(10): 772-777(in Chinese).

IdentificationoftheRelatedSubstancesofPidotimodbyLC/MS

ZHOU Rui-qi1, LIU Jie2, LIU Hui2, HANG Tai-jun1

(1.ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China; 2.HainanProvincialInstituteforDrugandFoodControl,Haikou570100,China)

Pidotimod (3-L-pyroglutamyl-L-thiaziolidine-4 carboxylic acid) is a synthetic dipeptide molecule with immunomodulatory properties. Since the early 90’s, a wide scientific production has been published about it. As it’s effective in the treatment of people infected with bacteria and viruses, it is used in the treatment of repeated infections of the respiratory, urogenital, and ear, nose, throat systems. Pidotimod therapy is a reliable, simple, and safe approach to treat children with recurrent respiratory infections. Liquid chromatography-mass spectrometry (LC/MS) method has been used for determination of pidotimod in different biological matrices. Only a few HPLC-UV methods have been reported for the quantification of the related substances in pidotimod and its formulation. The reported LC/MS methods usually use formic acid or acetic acid in the mobile phase which are not suitable for UV detector, and the separation is not feasible for the related substances. And the reported HPLC-UV methods usually use phosphate and phosphoric acid in the mobile phase which are not suitable for mass spectrometry detector. However, there is no reliable LC/MS method for identification of the related substances in pidotimod. In this paper, a LC/MS method was developed for the separation and characterization of process related substances and the major degradation products in pidotimod. Electrospray positive ionization high resolution time-of-flight mass spectrometer (ESI-TOF MS) was used for the determination of the accurate mass and elemental composition of the parent ions of the related substances, and triple quadrupole tandem mass was employed for the product mass spectra determination. The separation was performed on a Sepax GP-C8 column (250 mm×4.6 mm×5 μm) using 0.005% trifluoroacetic acid (TFA) in water as mobile phase A and methanol as mobile phase B. The flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was set at 30 ℃. Analytes were monitored at 210 nm. The injection volume was 20 μL. Pidotimod was tending to degrade under acid, alkaline, oxidative, thermal stress and photolytic stress. The structures of the related substances were then figured out through elucidation of the fragment ions. A total of 11 related substances were detected and characterized, including process related substances (related substances 1 and 4) and degradation products. Related substances 4 and 10 were identified by synthetic reference and related substances 1, 2, 8 and 9 were reported before this study, while related substances 3, 5, 6, 7 and 11 were reported for the first time. The method is effective for separation and identification of the related substances of pidotimod, and the results are useful for the quality control and process optimization of pidotimod.

pidotimod; related substances; degradation products; structure identification; liquid chromatography-mass spectrometry (LC/MS)

2016-12-22;

2017-05-10

周瑞琪(1991—)，女(汉族)，山东人，硕士研究生，药物分析专业。E-mail: ruiqi_qiqi@163.com

杭太俊(1963—)，男(汉族)，江苏人，博士生导师，从事药物分析研究。E-mail: hangtj@cpu.edu.cn

O657.63

：A

：1004-2997(2017)04-0433-10

10.7538/zpxb.2016.0207