细胞膜色谱在线HPLC-IT-TOFMS联用系统筛选分析射干中次野鸢尾黄素的抗EGFR活性作用

吕艳妮，付 佳，孔利云，韩省力，张 涛，贺浪冲

(西安交通大学药学院，陕西 西安 710061)

细胞膜色谱在线HPLC-IT-TOFMS联用系统筛选分析射干中次野鸢尾黄素的抗EGFR活性作用

吕艳妮，付 佳，孔利云，韩省力，张 涛，贺浪冲

(西安交通大学药学院，陕西 西安 710061)

中药射干具有多种药理作用并得到广泛研究，但对其抗肿瘤活性组分的研究较少。本研究建立了一种用于筛选射干中抗肿瘤活性组分的方法。利用高表达表皮生长因子受体(EGFR)细胞制备细胞膜色谱柱，并通过十通切换阀与高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱(HPLC-IT-TOF MS)构建成二维在线联用系统。利用吉非替尼验证该系统的适用性，分子模拟对接实验研究活性组分与受体的相互作用方式，并利用MTT实验研究所筛选组分对EGFR细胞的体外抑制作用。结果表明，利用该系统可从射干总提取物中筛选出能够作用于EGFR的活性成分，并鉴定为次野鸢尾黄素；次野鸢尾黄素与EGFR的相互作用方式与阳性药吉非替尼相似；在浓度为0.4～50 μmol/L范围内，吉非替尼、次野鸢尾黄素对高表达EGFR细胞的体外抑制作用具有剂量依赖性。EGFR细胞膜色谱在线HPLC-IT-TOF MS法有望成为从中草药中发现潜在抗肿瘤候选药物的有效方法。

细胞膜色谱；表皮生长因子受体(EGFR)；高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱(HPLC-IT-TOF MS)；次野鸢尾黄素；射干；抗肿瘤作用

中药(traditional Chinese medicine, TCM)具有几千年的历史，毒副作用小，在中国已被用于治疗各种慢性疾病[7]。射干(RhizomaBelamcandae)是鸢尾科射干属植物射干的干燥根茎，具有清热解毒、利咽消痰的作用，临床上常用于治疗咽喉肿痛、痰咳气短等症状[8]。有文献报道，从射干中分离出的鸢尾黄酮和鸢尾黄酮苷具有抑制血管生成活性，但其靶点尚不明确[9]。因此，亟需建立基于特定靶点的方法筛选中药复杂体系中的活性化合物。

高通量筛选是新药开发过程中寻找先导化合物的重要方法，如，直接基于受体或酶的筛选，计算机辅助药物设计的虚拟筛选等[10]。细胞膜色谱(cell membrane chromatography, CMC)是由贺浪冲教授和他的团队于1996年发明的一种新型色谱技术[11]。细胞膜色谱不仅具有色谱的分离能力，同时兼具生物活性，是一种从中药复杂体系中筛选中药活性成分的有效方法[12-13]。20世纪90年代以来，高效液相色谱-质谱联用技术已广泛应用于鉴定复杂样品。随着质谱仪的更新换代，高分辨质谱仪(如LC-IT-TOF MS)的出现及其广泛应用为未知样品的鉴定提供了更准确的方法[14]。多维液相色谱也已广泛应用于中草药的分离鉴定[15]。

本研究拟利用高表达EGFR细胞，建立一种EGFR细胞膜色谱模型。通过十通阀将细胞膜色谱与液相色谱-质谱联用仪构成二维在线联用系统，并将其应用于射干总提物中作用于EGFR的活性组分筛选，通过受体-配体对接实验以及体外细胞增殖抑制实验等验证筛选结果。

1 实验部分

1.1主要仪器与条件

HPLC-IT-TOF MS液相色谱-质谱联用仪：日本Shimadzu公司产品，配有两台LC-20AD色谱泵、SIL-20AC自动进样器、CBM-20A控制器、CTO-20A柱温箱、SPD-M20A二极管阵列检测器、电喷雾离子源(ESI)和LC/MS Solution工作站。

细胞膜色谱柱和HPLC-IT-TOF MS系统通过十通阀搭建成二维在线联用系统。

一维色谱条件：EGFR细胞膜色谱柱；流动相为超纯水；紫外检测器；吉非替尼检测波长为254 nm，次野鸢尾黄素检测波长为265 nm。

二维色谱条件：岛津Shim-Pack VP-ODS色谱柱(150 mm×2.0 mm×5 μm)；流动相为40%乙腈和60%冰醋酸水溶液；流速0.2 mL/min；二极管阵列检测器。

色谱柱均置于37 ℃柱温箱中。

金秋在即，农业生产用肥开始热销。山东红日化工股份有限公司加班加点生产肥料，以满足农作物生长需求。 刘海青摄

质谱条件：电喷雾离子源；雾化气和干燥气均为高纯氮气，纯度>99.999%；雾化气流速1.5 L/min；干燥气压力109 kPa；曲线脱溶剂管线(CDL)温度200 ℃；加热模块温度200 ℃；接口电压4.5 kV；检测电压1.57 kV；碰撞诱导裂解(CID)气为高纯氩气，纯度>99.999%；CID能量50%；离子累积时间30.0 ms；正负离子扫描模式，扫描范围m/z50～1 000。

1.2主要材料与试剂

色谱硅胶(规格：ZEX-Ⅱ，5 μm，200 Å)：青岛美高集团有限公司产品；射干中药材：购于西安药材市场，经西安交通大学药学院生药教研室牛晓峰教授鉴定为鸢尾科植物射干Belamcandachinensis(L.) DC. 的干燥根茎，属道地药材；吉非替尼：纯度>98%，南京安格医药化工有限公司产品；次野鸢尾黄素(批号：131204)：纯度>98%，成都普菲德生物技术有限公司产品；甲醇、乙腈：均为色谱纯，德国Meck公司产品；EGFR高表达的HEK293细胞系为实验室前期构建；实验用水：超纯水，实验室自制；其他试剂均为分析纯。

1.3样品制备

将吉非替尼、次野鸢尾黄素对照品分别配制成1 g/L的储备液，待分析时用甲醇稀释至适宜浓度。对照品溶液应新鲜配制，并于-20 ℃避光保存。

射干提取物的制备：将干燥的射干用药部位粉碎，于60 ℃烘干1 h后，用8倍量的50%乙醇回流提取2 h，重复2次，合并提取液，减压蒸馏得到棕黄色的固体，即为射干总提物。分析时用甲醇溶解，经0.45 μm微孔滤膜过滤。

1.4细胞培养与细胞膜色谱柱制备

EGFR高表达的HEK293细胞培养条件：用含有10%胎牛血清的MEM培养基，在5%二氧化碳环境内于37 ℃条件下培养。实验用细胞均取自对数生长期细胞。当细胞计数达到107个/mL时，收集培养液，并用胰酶消化细胞，加入新鲜培养基终止消化，吹悬细胞，收集终止消化的细胞培养液与先前收集的培养液混合。将所得细胞悬液于4 ℃以1 000 g离心10 min，弃去上清液，所得沉淀物即为EGFR高表达的细胞。用生理盐水将其离心清洗2遍，加入50 mmol/L的Tris-HCl溶液，超声30 min破碎细胞。将悬液于1 000 g 4 ℃条件下离心，细胞膜悬浮在上清液中，收集上清液于12 000 g 4 ℃条件下离心20 min，所得沉淀即为细胞膜，用生理盐水重悬，清洗1次。将细胞膜悬液在真空条件下加入到具支试管(内含0.05 g已活化(105 ℃，30 min)的大孔硅胶)中，搅拌均匀后静置过夜。次日，采取湿法装柱得到EGFR细胞膜色谱柱。

1.5EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOFMS系统适用性

通过十通阀将EGFR细胞膜色谱柱与HPLC-IT-TOF MS系统构建成二维在线联用系统，利用阳性药吉非替尼考察EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS系统对活性组分的识别、分离、鉴定能力以及该系统的适用性。将5 μL 0.1 g/L吉非替尼进样分析，并将保留组分富集、切换进入二维系统分析，重复进样5次，以二维富集组分的峰面积为指标，考察富集的重现性。利用5次富集组分的峰面积得出富集后的平均峰面积，与直接进样的吉非替尼的峰面积相比，得出EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS系统的富集率。

1.6EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOFMS系统的应用

利用已经建立并验证的EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS系统对射干总提物进行识别-分析-鉴定能够作用于表皮生长因子受体的活性组分。为了验证射干总提物中活性成分的识别-分析-鉴定结果，利用EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS系统对所鉴定出的活性组分的对照品进行分析，验证筛选结果。

1.7受体-配体分子对接实验

利用SYBYL-X1.1对阳性药物吉非替尼以及筛选出的活性组分与表皮生长因子受体酪氨酸激酶(PDB ID：2ITY)进行分析，研究阳性药物吉非替尼以及筛选出的活性成分与表皮生长因子受体结合的打分值大小。采用优化的鲍威尔方法[16]进行分析。

1.8细胞增殖抑制实验

利用MTT实验考察阳性药物吉非替尼以及筛选出的活性组分对高表达EGFR细胞增殖的抑制效果。取对数生长期的细胞接种于96孔板中，细胞浓度约为5×104个/孔。孵育24 h后，用不同浓度的阳性药物吉非替尼以及筛选出的活性组分干预细胞，48 h后，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，弃去上清后每孔加入150 μL DMSO，利用酶标仪在490 nm处测定细胞的光密度值[17]。

2 结果与讨论

2.1EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOFMS系统建立及适用性考察

图1 应用EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS系统分析吉非替尼的结果Fig.1 Chromatograms of gefitinib using EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS method

利用十通阀将EGFR细胞膜色谱柱与HPLC-IT-TOF MS系统构建成二维的EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS系统。采用阳性药物吉非替尼考察该系统的适用性，结果示于图1。图1a是吉非替尼在EGFR细胞膜色谱柱上的色谱图，有明显的保留组分R；图1b为HPLC-IT-TOF MS系统直接分析吉非替尼的色谱图；图1c为保留组分R经富集切换进入HPLC-IT-TOF MS系统后的色谱图，经质谱鉴定为吉非替尼。将0.1 g/L吉非替尼进样5 μL，并将保留组分富集切换进入二维分析，重复5次，以二维系统富集组分的峰面积为指标，考察富集的重现性。计算得到富集组分峰面积的相对标准偏差为3.95%(n=5)；利用5次富集组分的峰面积得出富集后的平均峰面积，与直接进样分析吉非替尼所得的峰面积相比，得到EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS系统的富集率为81.1%。综上所述，EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS系统能够满足识别-分析-鉴定的要求。

2.2联用系统应用——中药活性组分筛选

利用EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS系统对射干总提物进行分析，结果示于图2。图2a是射干总提物的EGFR细胞膜色谱图，图中具有明显的不保留组分R0和保留组分R1(保留时间约为8 min)；图2b是射干总提物的直接HPLC-IT-TOF MS色谱图；图2c是射干总提物的保留组分R1经富集切换至HPLC-IT-TOF MS系统的色谱图，经质谱分析和分子式预测软件推测可能为次野鸢尾黄素，其裂解方式示于图3。

2.3筛选结果的验证

为验证2.2节的筛选结果，利用EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS系统分析次野鸢尾黄素对照品，其结果示于图4。图4a表明，次野鸢尾黄素在高表达EGFR细胞膜色谱柱上有明显的保留组分R(保留时间约为8 min)；图4b是次野鸢尾黄素的直接HPLC-IT-TOF MS色谱图；图4c是保留组分R经富集切换至HPLC-IT-TOF MS系统的色谱图，质谱鉴定为次野鸢尾黄素。

综上所述，射干总提物中能够作用于EGFR受体的活性组分经过二维在线联用系统的筛选、分析，鉴定为次野鸢尾黄素。

2.4受体-配体对接实验

受体-配体之间的分子对接实验通常用于预测配体与受体之间的结合位点以及配体和受体之间的亲和力大小。本研究利用分子对接分析了吉非替尼和次野鸢尾黄素与EGFR蛋白的结合位点以及亲和力大小。利用SYBYL-X1.1从蛋白数据库中选出EGFR酪氨酸激酶(PDB ID：1M17)，将吉非替尼和次野鸢尾黄素与EGFR酪氨酸激酶进行自动对接，结果示于图5，次野鸢尾黄素与吉非替尼和EGFR的作用位点相同。

图2 射干总提物应用EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS系统的分析结果Fig.2 Chromatograms of the total extract of Rhizoma Belamcandae using EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS method

图3 次野鸢尾黄素质谱裂解图Fig.3 Mass spectral fragmentation pathway of irisflorentin

图4 次野鸢尾黄素对照品应用EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS系统的分析结果Fig.4 Chromatograms of irisflorentin using EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS method

注：a.吉非替尼；b.次野鸢尾黄素图5 两种化合物与EGFR(PDB ID：2ITY)分子对接结果Fig.5 Results of two compounds docking with EGFR (PDB ID：2ITY)

2.5细胞增殖抑制实验

利用MTT实验研究吉非替尼和次野鸢尾黄素对高表达EGFR细胞的抑制作用，结果示于图6。在剂量0.4～50 μmol/L范围内，吉非替尼和次野鸢尾黄素对高表达EGFR细胞的抑制作用具有明显的剂量依赖性。体外抑制高表达EGFR细胞增殖能力强弱为吉非替尼>次野鸢尾黄素，此结果与吉非替尼和次野鸢尾黄素在高表达EGFR细胞膜色谱柱上的保留时间结果一致。

图6 吉非替尼和次野鸢尾黄素对细胞的增殖抑制作用Fig.6 Effect of gefitinib and irisflorentin on EGFR cell viability

3 结论

建立了一种EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS二维在线联用系统用于射干总提物中EGFR活性组分的筛选和鉴定。次野鸢尾黄素被证实是作用于EGFR受体的活性成分。竞争抑制实验和自动对接实验表明，吉非替尼和次野鸢尾黄素作用于相同的靶点；细胞增殖抑制实验表明，次野鸢尾黄素能抑制高表达EGFR细胞的增殖。该方法有望成为基于EGFR受体的中草药中筛选抗肿瘤候选药物的有效方法。

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EGFRAntagonismoftheIrisflorentinfromRhizomaBelamcandaeUsingCMC-Online-HPLC-IT-TOFMSSystem

LV Yan-ni, FU Jia, KONG Li-yun, HAN Sheng-li, ZHANG Tao, HE Lang-chong

(SchoolofPharmacy,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China)

RhizomaBelamcandae(Shegan), obtained from the dried rhizome ofBelamcandachinensis(L.) DC., is one of the most important traditional Chinese medicines (TCMs). It has many pharmacological effects, such as eliminating toxins, heat, phlegmand dyspnea, antiviral effect, anti-inflammatory, etc. In recent years, studies on Shegan were increasing, and reports showed that tectorigenin and tectoridin separated from Shegan had the activity of inhibiting angiogenesis, however, the targets which they act with were uncertain. Hence, screening receptor-specific components with anti-tumor effect from Shegan is necessary. Epidermal growth factor receptor (EGFR) is a part of the tyrosine kinase family of receptors responsible for intracellular signalling and cell growth, and overexpression of EGFR is associated with angiogenesis, invasion and metastasis of cancer cells. Cell membrane chromatography (CMC) has its history of more than 20 years, it was established in 1996 by professor He and his colleagues. As a kind of biological affinity chromatography, CMC has been developed and confirmed to be an effective method for screening bioactive components from complex systems. In this study, a two-dimensional online system was built to screen active compounds acting on epidermal growth factor receptor fromRhizomaBelamcandae. The first dimension was EGFR/CMC system, and the second was HPLC-IT-TOF MS system. Gefitinib was selected as the positive control drug to investigate the suitability of the EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS system. For the EGFR/CMC system, the EGFR HEK293 engineered cell line was cultured and used to prepare the EGFR/CMC column according to the wet packing method, after analysing total extracts of Shegan through the EGFR/CMC system, the retained fractions were switched to the second dimension for identification. Molecular docking assay was performed using the SYBYL-X1.1 software to determine the strength of binding between the screened components and EGFR, and methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay were used to evaluate theinvitroinhibition activity of the target components. The screening results showed that irisflorentin fromRhizomaBelamcandaewas the targeted component which could specifically act on EGFR. Molecular docking assay showed irisflorentin could act on EGFR in similar manner with gefitinib as a positive control drug. The results of MTT assay showed gefitinib and irisflorentin inhibited high expressed EGFR cell growth in a dose-dependent manner from 0.4 to 50.0 μmol/L. These results indicated that EGFR cell membrane chromatography online high performance liquid chromatography-ion trap-time of flight-mass spectrometry (EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF MS) system would be a useful method in drug discovery with natural medicinal herbs for searching potential anti-tumor candidates.

cell membrane chromatography; epidermal growth factor receptor (EGFR); high performance liquid chromatography-ion trap-time of flight-mass spectrometry (HPLC-IT-TOF MS); irisflorentin;RhizomaBelamcandae; anti-tumor

10.7538/zpxb.2016.0203

2016-12-17;

2017-03-15

国家自然科学基金(81503032、 81230079、81227802)；国家博士后基金项目(2015 M570844、2016 T90930)；陕西省博士后科学基金；中央高校基本科研业务费资助

吕艳妮(1992—)，女(汉族)，陕西富平人，博士研究生，药物分析专业。E-mail: xl03130058@stu.xjtu.edu.cn

贺浪冲(1957—)，男(汉族)，陕西榆林人，教授，从事中药物质基础研究及细胞膜色谱技术、理论及应用研究。E-mail: helc@mail.xjtu.edu.cn

O657.63

：A

：1004-2997(2017)04-0425-08