β-葡萄糖苷酶对刺梨汁香气物质的影响

彭邦远，罗昱，张洪礼，丁筑红*

（贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室，贵州省药食同源植物资源研究开发中心，贵州贵阳550025）

β-葡萄糖苷酶对刺梨汁香气物质的影响

彭邦远，罗昱，张洪礼，丁筑红*

（贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室，贵州省药食同源植物资源研究开发中心，贵州贵阳550025）

以贵州龙里刺梨为研究对象，通过AmberliteXAD-2树脂对刺梨汁中游离态和键合态香气物质进行分离，不同来源β-葡萄糖苷酶酶解刺梨汁，经气质联用（GC-MS）仪分析，比较其酶解效果及差异性。结果表明，木霉β-葡萄糖苷酶酶解刺梨汁释放11种风味物质。杏仁β-葡萄糖苷酶酶解释放26种风味物质，其中叶醇、己醇、茶香酮、异香叶醇、紫罗烯、棕榈酸等20种风味物质均为嗅感物质且含量较高，可作为刺梨汁的增香酶制剂。刺梨汁中共检测出43种游离态风味物质，主要以酚类和酯类为主；通过杏仁β-葡萄糖苷酶酶解后检出33种键合态风味物质，以酮类和醛类为主，8种物质同时存在于游离态和键合态物质中，且在键合态中释放出新的风味物质26种。关键词：刺梨；β-葡萄糖苷酶；游离态化合物；键合态化合物

刺梨（Rosa roxburghiiTratt.）果实富含多种营养物质，在加工贮藏过程中易于变化损失，导致果汁色泽褐变、口感劣变和风味物质逸散等现象[1]，使刺梨果汁产品质量波动较大，难以让刺梨这一优越的自然资源在市场流通消费周期中很好地体现其优势特征。水果中的香气物质包括游离态物质与键合态物质，而水果中的香气主要是以游离态挥发性物质呈现，糖苷键合态物质是水果中最重要的一种键合态香气物质，无挥发性，以糖苷形式存在于水果中[2-3]，目前国内外关于水果中键合态香气物质的研究不断深入，不同水果所含有的风味组分固然不同，周志等[4]分析了刺梨皮渣与籽仁中的游离态和键合态挥发性物质并进行比较；张正竹等[5]初步分离了糖苷类香气前体物质，并释放出相应的挥发性糖苷配基。由于风味前体物没有芳香气味，目前多采用酸解和酶解的方法将其分解，释放出其中的键合态化合物，以达到增香的目的[6]。

果汁通过风味酶酶解处理，可释放出风味前体中的键合态风味物质，可增加、强化果汁的风味。GUEGAEN Y等[7]研究表明风味酶可从不同的水果中释放出丰富的萜烯类化合物，已成为水果制品增香的重要方法。常用的风味酶是杏仁来源和微生物来源的β-葡萄糖苷酶。孙爱东等[8]比较了微生物β-葡萄糖苷酶和杏仁β-葡萄糖苷酶释放橘子皮和橘子汁中糖苷键合态芳香化合物的能力。发现杏仁酶水解橘子汁中键合态挥发性物质的效果优于微生物酶，而微生物酶处理橘子皮键合态挥发性物质的效果优于杏仁酶。CHYAU C C等[9]用AmberliteXAD-2吸附树脂分离荔枝汁中游离态和糖苷键合态的风味物质，利用β-葡萄糖苷酶释放以糖苷键合态存在的风味物质，发现键合态成分在水解前无味道，但当其水解后与游离态风味物质混合则呈现一种强烈的荔枝水果香气。

本研究探讨不同来源的酶酶解刺梨汁中键合态物质，对比分析酶解前后游离态与键合态化合物的差异性以及两种不同来源酶的酶解效果，对阐明刺梨汁的香气组成和探究刺梨产品在加工过程中释放潜在的挥发性成分提供一定的理论基础与依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

刺梨：贵州龙里刺梨，本地人工种植，充分成熟，新鲜无霉烂变质。

AmberliteXAD-2树脂、正戊烷（色谱纯）：美国Supelco公司；杏仁β-葡萄糖苷酶（从杏仁中提取，0.1 U/mg）和木霉β-葡萄糖苷酶（从黑曲霉的粗酶中提取，0.408 U/mg）：美国Sigma公司；浓盐酸、氢氧化钠、乙醇、甲醇、Na2HPO4、NaH2PO4、乙醚（均为分析纯）：成都金山化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HP6890/5975C气相色谱-质谱联用（gaschromatographymassspectrometer，GC-MS）仪：美国Agilent公司；手动固相微萃取装置，萃取纤维头为2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex，美国Supelco公司；ZZ102九阳榨汁机；佛山市顺德区顺科电器有限公司；XMTD-204数显恒温水浴锅；上海梅香仪器有限公司；R201旋转蒸发仪；上海申胜生物技术有限公司；DBS-全自动部分收集器、DHL-电脑恒流泵：上海青浦沪西仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 刺梨果汁制备

将新鲜刺梨经挑选、破碎、清洗、沥干后使用榨汁机榨汁，真空脱气后贮藏在-18℃的冰箱中备用。

1.3.2 刺梨汁中游离态挥发性物质的萃取

将备用刺梨汁取出，自然解冻，4层纱布过滤，在4℃，10 000 r/min条件下离心20 min后，得到上清汁，取样品约5mL，置于10mL固相微萃取仪采样瓶中，插入装有2cm-50/ 30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纤维头的手动进样器，在85℃左右萃取30min，快速移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口（温度250℃）中，热解吸3min，经GC-MS分析。

1.3.3 AmberliteXAD-2树脂预处理[10-11]

将AmberliteXAD-2树脂置于5%盐酸中浸泡24 h后，用蒸馏水洗至中性；再浸泡于5%氢氧化钠中24 h后，用蒸馏水洗至中性；最后于75%乙醇中浸泡24 h，用蒸馏水洗至无醇味，贮藏于甲醇中备用。使用时将贮存洗净的XAD-2树脂以甲醇为溶剂进行湿法装柱，用蒸馏水洗柱至无味。

1.3.4 有机洗脱剂分离刺梨果汁中游离态与键合态挥发性成分

将刺梨汁自然解冻，纱布过滤，在4℃，10000r/min条件下离心20 min后，将得到的清汁（约100 mL）以2 mL/min的流速流经预处理好的AmberliteXAD-2树脂柱，用750 mL去离子水清洗柱子，去除刺梨果汁中的水溶性酸和糖，200mL乙醚/戊烷（1∶1，V/V）以3 mL/min的流速过柱去除游离态挥发性物质[7]。用300 mL甲醇以3 mL/min的流速，洗脱吸附在树脂柱上的键合态风味前体物，并收集甲醇洗脱部分置于旋转蒸发仪上（水浴温度40℃）浓缩至干，用pH 5.0、0.06 mol/L的柠檬酸-Na2PO4缓冲液40 mL溶解，用30 mL乙醚/戊烷（1∶1）分别萃取3次，以去除其中可能存在的游离态挥发性物质，萃取后水相即为键合态风味前体物[12]。

1.3.5 键合态挥发性物质的酶解释放

称取杏仁β-葡萄糖苷酶与木霉β-葡萄糖苷酶138 mg，分别置于50 mL顶空瓶中，注入样品水相，立即用PTFE/硅橡胶隔垫密封，放入磁力搅拌水浴锅中40℃酶解36h，冷却，开启后用80 mL乙醚-戊烷（1∶1，V/V）混合液分3次萃取酶解液，有机相用无水硫酸干燥，N2浓缩至0.5 mL[8]，取1 μL供GC-MS分析。

1.3.6 GC-MS分析

GC条件：色谱柱为ZB-5MSI 5%二苯基-95%二甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），柱温45℃，保持2 min，以4℃/min升温至220℃，保持2 min；汽化室温度250℃；载气为高纯氦气（99.999%）；柱前压7.62 psi，载气流速1.0 mL/min；不分流进样；溶剂延迟时间：1.5 min。

MS条件：离子源为电子电离（electronic ionization，EI）源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；倍增器电压1 615 V；接口温度280℃；质量范围20～450 amu。

1.3.7 定性定量分析

对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及核对NIST 2005和Wiley 275标准质谱图以及参考文献，确定挥发性化学成分组成，用峰面积归一化法测定各化学成分的相对质量分数。

2 结果与分析

2.1 不同来源的β-葡萄糖苷酶酶解效果的比较

杏仁β-葡萄糖苷酶与木霉β-葡萄糖苷酶分别酶解刺梨汁释放键合态风味物质，两种不同来源酶酶解所释放键合态挥发性组分具有明显差异，具体风味物质及相对含量见表1。由表1可知，采用木霉β-葡萄糖苷酶酶解刺梨汁中键合态风味前体物，释放出10种键合态风味物质，一种未知物质，其相对含量为66.31%；杏仁β-葡萄糖苷酶酶解释放出26种风味物质，释放出一种未知物质，其释放的键合态风味物质相对含量为73.41%，香气的损失率低于木霉β-葡萄糖苷酶的酶解。杏仁β-葡萄糖苷酶酶解释放出叶醇（3.23%）、己醇（0.90%）、茶香酮（1.08%）、异香叶醇（0.58%）、紫罗烯（0.82%）、棕榈酸（0.15%）等20种木霉β-葡萄糖苷酶未释放出的键合态风味物质，且多为嗅感物质。其中2-丁烯醛具有淡淡的苹果香，叶醇具青草香与茶香，壬醛具有玫瑰香与柑橘香，茶香酮具有茶香，苯乙醚、3,4-二甲氧基苯乙烯具有芳香味，辛酸、棕榈酸具有一定的苹果香，紫罗烯的青草香[13-16]，这些香气的产生是杏仁β-葡萄糖苷酶酶解后所产生的，可能是构成刺梨复杂浓郁香气的一部分，木霉β-葡萄糖苷酶酶解刺梨汁所不具备，木霉β-葡萄糖苷酶酶解后也产生了5种新物质，分别为正丁醇（0.57%）、苯基丙酮（0.35%）、3,5-二甲基苯甲醛（0.36%）、去氢白菖烯（0.11%）、3,5-二叔丁基苯酚（0.38%）。所产生的新物质并不具备相应的香气成分，故使用杏仁β-葡萄糖苷酶酶解后的刺梨汁香味较强于木霉β-葡萄糖苷酶所处理的刺梨汁，这与孙爱东等[8]利用两种不同来源酶酶解橘子汁效果研究结果一致。因此，杏仁β-葡萄糖苷酶可作为刺梨汁的风味增香酶的理想酶之一。

表1 杏仁和木霉β-葡萄糖苷酶酶解键合态风味物质比较Table 1 Comparison of flavor substance hydrolyzed by β-glucosidase from almond and trichoderma

保留时间/化合物相对含量/% min杏仁木霉23.1213,4-二甲氧基苯乙烯0.11-26.448异丁香酚甲醚0.26-26.8813,5-二叔丁基苯酚-0.38 26.8912,4-二叔丁基苯酚0.39-35.175二十烷0.06-36.617棕榈酸0.15-38.992二十一烷0.03-41.43314β-孕烷0.02-未知1.340.25

2.2 刺梨果汁游离态与键合态风味物质比较

刺梨汁中游离态风味物质及键合态风味物质的GC-MS分析结果见图1，刺梨果汁游离态与键合态风味物质鉴定结果见表2。对刺梨汁游离态和键合态的风味物质类别、数量级相对含量进行汇总，结果见表3。

图1 刺梨汁中游离态（A）及键合态（B）化合物GC-MS分析Fig.1 GC-MS analysis of free(A)and bound(B)aroma compounds inRosa roxburghiijuice

由表2和表3可知，采用杏仁β-葡萄糖苷酶酶解释放后，游离态风味物质共有43种，相对含量75.57%，其中烃类物质13种，醇类物质10种，酯类物质6种，酮类物质6种，酚类物质4种，醛类物质1种以及其他3种物质，其中以酚类和酯类物质相对含量较高，分别为27.68%和17.41%，其次为烃类16.72%和醇类8.09%。检测出的键合态风味物质共有33种，其相对含量占80.95%，与游离态风味物质相比增加了5.38%，其中酮类、醛类各6种，醇类4种，烃类5种，酚类3种，酯类、酸类各2种，其他5种；且有8种风味物质在键合态和游离态组分中均被检出。张瑶等[17]对经β-葡萄糖苷酶处理的柠檬汁进行研究，发现酶解处理可释放出新的潜在香气物质，且对原汁香气的协调性没有影响，这与本实验所得出的结论相似。刺梨果汁中风味前体在杏仁β-葡萄糖苷酶的作用下，释放出大量键合态风味物质，其中叶醇、7,9-二叔丁基-1-氧杂螺（4,5）癸烯二酮、乙酸乙酯、二十烷、二十一烷、对乙烯基愈疮木酚、2,4-二叔丁基苯酚、苯甲醛8种风味物质也在游离态组分中检出。

表2 刺梨果汁游离态与键合态风味物质鉴定结果Table 2 Identification results of free and bound aroma compounds inRosa roxburghiijuice

续表

表3 刺梨汁游离态和键合态风味物质比较Table 3 Comparation of free and bound aroma compounds in Rosa roxburghiijuice

刺梨果汁中游离态风味物质含有丰富的2,4-二叔丁基苯酚、对乙烯基愈疮木酚等酚类物质；其次还含有苯二甲酸丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、酞酸乙酯、安息香酸乙酯、乙酸乙酯等酯类物质；醛类物质含量相对较少；醇类物质以轻快香味的乙酸乙酯、环戊醇、异辛醇、沉香醇、甲基丁子香酚等香气成分以及叶醇（青草香）、2-庚酮（梨香）、苯甲醛（苦杏仁味）、甲基庚烯酮（青草、柑橘味）、安息香酸甲酯（冬青油香）、安息香酸乙酯（果香）、α-松油醇（薰衣草香）、β-紫罗兰酮（玫瑰香）、雪松醇（杉木芳香）等嗅感物质为主[13]，可能对刺梨果汁天然香气的构成起重要作用。

与宣恩野生种刺梨汁中游离态风味物质相比[18]，本实验所用本地刺梨汁中还检测出苯甲醛、安息香酸甲酯、安息香酸乙酯、β-紫罗兰酮和苯二甲酸丁酯等在宣恩刺梨汁中没有检测出的风味物质，刺梨汁游离态风味物质中含有丰富的低沸点酯类物质，但萜烯烃类物质不及宣恩野生种刺梨，这可能是由于刺梨产地和品种不同的原因导致的。采用杏仁β-葡萄糖苷酶酶解后，产生明显的香味，可见酶解释放出的键合态风味物质对刺梨果汁香气提升有重要作用。对风味前体物质使用β-葡萄糖苷酶酶解，释放出的33种键合态风味物质，其中有26种在游离态风味物质中未检出，分别是己醇、茶香酮（茶香）、甲酸乙酯（菠萝香）、二甲基1,3,5-三庚烯、紫罗烯（青草味）、3,4-二甲氧基苯乙烯（芳香味）、辛酸（苹果香）、棕榈酸（苹果香）、乙醛（苹果香）、2-丁烯醛（苹果香）、壬醛（玫瑰香）、苯甲醛、苯乙醚（芳香味）、异丁香酚甲醚、1,1,6-三甲基-1,2-二氢萘等。其中具有酒香的己醇和具有类似杏仁香味苯甲醛在怀枝荔枝[10]、山楂[18]和哈密瓜以键合态风味物质存在并经酶解后释放出来。杏仁β-葡萄糖苷酶的活性尽管比微生物来源的β-葡萄糖苷酶低，但是杏仁β-葡萄糖苷酶具有多种多样的功能，特别是其能够耐受较高浓度的葡萄糖，使其应用远比微生物来源的β-葡萄糖苷酶广泛和更有价值[19]。杏仁β-葡萄糖苷酶能够耐受刺梨汁中较高浓度的葡萄糖，而木霉β-葡萄糖苷酶容易失活，这可能是导致两种酶酶解效果不同的原因之一。另外，酶解效果的差异还在于两者对酶解条件的适应不同。

3 结论

结合GC-MS分析，比较杏仁β-葡萄糖苷酶和木霉β-葡萄糖苷酶对刺梨汁的酶解效果，采用木霉β-葡萄糖苷酶酶解刺梨汁中键合态风味前体物，释放出的键合态风味物质有11种，其中一种为未知物质；采用杏仁β-葡萄糖苷酶酶解释放出26种，同样检出一种未知物质，其中叶醇、己醇、茶香酮、异香叶醇、紫罗烯、棕榈酸等20种木霉β-葡萄糖苷酶未释放出的键合态风味物质均为嗅感物质且具有一定的水果香气，因此，杏仁β-葡萄糖苷酶的酶解效果优于木霉β-葡萄糖苷酶，并可作为刺梨汁香气释放的优选酶之一。

刺梨汁中共检测出43种游离态风味物质，主要为酚类和酯类物质；检测出经植物来源的杏仁β-葡萄糖苷酶酶解键合态前体物释放的风味物质33种，以酮类和醛类为主。游离态和键合态风味物质间差异较大，只有8种物质同时在游离态和键合态中存在，且在键合态中释放出新的风味物质26种，其中己醇（酒香）、茶香酮（茶香）、甲酸乙酯（菠萝香）、紫罗烯（青草味）、3,4-二甲氧基苯乙烯（芳香味）、辛酸（苹果香）、棕榈酸（苹果香）、乙醛（苹果香）、2-丁烯醛（苹果香）、壬醛（玫瑰香）、苯甲醛（杏仁味）、苯乙醚（芳香味）等具有明显的香气。酶解释放的键合态风味物质有多种呈香成分，对增强刺梨汁的香气有一定贡献。

[1]曾芳芳，罗自生.刺梨营养成分的研究进展[J].浙江农业科学，2015，56（11）：1753-1757.

[2]范刚，王可兴，潘思轶.水果中糖苷键合态香气物质的研究进展[J].中国农业科学，2010，43（24）：5100-5111.

[3]程焕，陈健乐，周晓舟，等.水果香气物质分析及合成途径研究进展[J].中国食品学报，2016，16（1）：212-218.

[4]周志，汪兴平，朱玉昌，等.刺梨皮渣和籽仁中游离态和键合态香气物质的比较[J].食品科学，2014，35（22）：121-125.

[5]张正竹，宛晓春，陶冠军.茶鲜叶中糖苷类香气前体的液质联用分析[J].茶叶科学，2005，25（4）：275-281.

[6]GUNATA Y Z,BAYONOVE C L,BAUMES R L.The aroma of grapes. I.Extraction and determination of free and glycosidically bound Fractions of some grape aroma components[J].J Chromatogr,1985,33:83-90.

[7]GUEGUEN Y,CHEMARDIN P,JANBON G,et al.A very efficient beta-glucosidase catalyst for the hydrolysis of flavor precursors of wine and fruit juices[J].J Agr Food Chem,1996,44(8):2336-2340.

[8]孙爱东，葛毅强，蔡同一.不同来源的增香酶酶解橙汁（皮）中键合态主要芳香物质的效果分析[J].食品与发酵工业，2001，27（11）：1-4.

[9]CHYAUACC,KOPT,CHANGCH,et al.Free and glyeosidicallybound aromacompoundsinlychee(LitchichinensisSonn)[J].Food Chem,2003,80(3):387-392.

[10]李春美，郝菊芳，钟慧臻.怀枝荔枝中游离态和键合态风味物质的检测分析[J].食品科学，2010，31（24）：268-271.

[11]SELLIS,CABAROGLU T,CANBAS A.Volatile flavour components of orange huice obtained from the cv.Kozan of Turkey[J].J Food Compos Anal,2004,17(6):789-796.

[12]任婧楠，荣茂，金瑶.树莓汁中游离态和键合态香气物质的成分分析[J].食品科学，2013，34（2）：199-203.

[13]周志，马琼，朱玉昌，等.GC-O-MS法分析野生刺梨汁游离态和O-糖苷键合态香气活性物质[J].食品科学，2015，36（22）：80-84.

[14]ANNE P,CARLOS A M,KEVIN L G,et al.Odour and flavour thresholds for key aroma components in an orange juice matrix:terpenes and aldehydes[J].Flavour Fragran J,2004,19(2):491-498.

[15]PANG X,GUO X,QIN Z,et al.Identification of aroma-active compounds in jiashi muskmelon juice by GC-O-MS and OAV calculation [J].J Agr Food Chem,2012,60(17):4179-4185.

[16]KANG W,LI Y,XU Y,et al.Characterization of aroma compounds in Chinese bayberry(Myricarubra sieb.et Zuce.)by gas chromatography mass spectrometry(GC-MS)and olfactometry(GC-O)[J].J Food Sci, 2012,77(10):1030-1035.

[17]张瑶，蒲彪，刘云.柠檬果汁酶解前后香气成分比较研究[J].检测与分析，2009，12（2）：40-44．

[18]宛晓春，汤坚，丁霄霖.山楂中游离态和键合态风味化合物[J].食品与发酵工业，1998，24（2）：20-26.

[19]赵丽莹，拱健婷，米文娟，等.苦杏仁中β-葡萄糖苷酶活性测定条件的研究[J].中南药学，2017，15（2）：166-169.

Effect of β-glucosidase on the volatile compounds ofRosa roxburghiijuice

PENG Bangyuan,LUO Yu,ZHANG Hongli,DING Zhuhong*
(Research and Development Center of Medicinal and Edible Plant Resources of Guizhou Province,Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Store and Processing of Guizhou Province,College of Liquor and Food Engineering, Guizhou University,Guiyang 550025,China)

UsingRosa roxburghiijuice from Longli,Guizhou Province as raw material,the free and bound volatile components inR.roxburghiijuice were separated with Amberlite XAD-2 column.The enzymolysis effect and the differences were compared by GC-MS analysis of juices hydrolyzed by β-glucosidese from different origins.with.The results indicated that the juice hydrolyzed by trichoderma β-glucosidase released 11 kinds of volatile compounds,and the juice hydrolyzed by almond β-glucosidase released 26 kinds of volatile compounds.Alcohol,hexanol,oxoisophorone, isosorbide,violet,palmitic acid and 20 kinds of volatile compounds were detected,all of them were olfactory substances with high content.Almond β-glucosidase could be used as flavouring enzymes ofR.roxburghiijuice.43 kinds of free volatile compounds were detected inR.roxburghiijuice, most of them were phenols and esters.33 kinds of bound volatile compounds were detected by almond β-glucosidase with ketones and aldehydes. 8 volatile compounds were detected in both free and bound compounds,26 new volatile compounds were discovered in the bound compounds.

Rosa roxburghii;β-glucosidase;free compound;bound compound

TS207.3

0254-5071（2017）07-0172-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.037

2017-03-03

贵州省重大科技攻关项目（黔科合重大专项字[2013]6006）；贵州省药食同源植物资源研究开发中心项目（黔科合G字[2014]4003号）

彭邦远（1992-），女，硕士研究生，研究方向为食品科学。

*通讯作者：丁筑红（1966-），女，教授，本科，研究方向为农产品加工。