薏仁米糠蛋白酶法提取工艺的优化

任勰珂，陈莉*，卢红梅，高冰，贾青慧，王珍

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；2.贵州大学化学与化工学院，贵州贵阳550025；3.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳550025；4.湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北武汉430068）

薏仁米糠蛋白酶法提取工艺的优化

任勰珂1，3，陈莉1，3*，卢红梅1，3，高冰4，贾青慧2，3，王珍1

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；2.贵州大学化学与化工学院，贵州贵阳550025；3.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳550025；4.湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北武汉430068）

为了研究酶法提取薏仁米糠蛋白的最佳工艺，在单因素试验的基础上，采用Box-Benhnken试验设计，利用响应面法优化薏仁米糠蛋白的提取条件。分析回归方程确定薏仁米糠蛋白提取率的影响因子，确定最佳提取工艺为料液比1∶29（g∶mL），酶解温度50℃，酶解时间1.5 h，酶解pH 9.8。在此最佳提取工艺条件下，薏仁米糠蛋白平均提取率79.66%，产品纯度为73.42%。

薏仁米糠蛋白；提取；酶法；响应面优化

薏苡（Coix lacrymajobiL.）为禾本科（Gramineae），属草本植物，其干燥成熟的种仁称为薏苡仁，也俗称为薏仁米、苡仁米、薏米等。贵州省薏仁米资源丰富，黔西南州兴仁县更是在2012年被中国粮食协会授予“中国薏仁米之乡”的称号，薏仁米蛋白质、脂肪、矿物质等含量远远超过大米，多用于药品和食品方面[1]。薏仁米糠是薏仁米在加工成精米过程中产生的黄粉，约占其总质量的5%。薏仁米糠含有丰富的营养因子，营养成分与米糠相似[2]，其粗多糖、薏苡酯、黄酮等功能性成分均高于其胚乳[3]，目前主要在畜牧业中用作饲料[4]，国外研究证明米糠作为健康食品的原料加以深度开发利用，可增值60倍左右[5]。目前国内外对薏仁米的研究主要集中在营养分析、加工利用、活性成分等方面，对薏仁米糠中蛋白提取的研究较少[6]。蛋白质是人类赖以生存和发展的物质基础，植物蛋白资源丰富、廉价，并具有独特的生理功能，对其开发利用已成为当今的热点[7-8]。本实验以薏仁米糠为原料，采用酶法提取蛋白质，优化提取条件以提高薏仁米糠蛋白提取率，研究成果有利于拓宽薏仁米糠的利用价值，提高其附加值，促进资源再利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

薏仁米糠：贵州兴诚华英食品有限公司。粉碎后用石油醚振荡脱脂，风干后4℃保存备用。纤维素酶（50 U/mg）、碱性蛋白酶（200 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg）、酸性蛋白酶（100 U/mg）、复合蛋白酶（120 U/mg）：上海源叶生物科技有限公司。

1.1.2 试剂

石油醚（沸程60～90℃）、硫酸钾、氢氧化钠、硼酸、浓盐酸、浓硫酸（均为分析纯）：天津市瑞金特化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

HH-b型数显恒温水浴锅：常州奥华仪器有限公司；ZD-2A自动电位滴定仪：上海大普仪器有限公司；CJJ-781磁力加热搅拌器：城西晓阳电子仪器厂；722S可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；SH220石墨消解仪：济南海能仪器股份有限公司；DHG-9140B恒温鼓风干燥箱：上海琅玕实验设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 薏仁米糠蛋白提取工艺流程及操作要点

酶法提取：以蛋白提取率为指标先确定试验用酶，确定酶种类后，在最佳提取条件下酶解，酶解过程中pH通过滴加10%NaOH溶液；

灭酶：恒温水浴锅85℃，灭酶10 min；

离心：4 000 r/min离心15 min，取上清液待用；

上清液等电点沉淀：用15%的盐酸调上清液pH至4.20，待蛋白沉淀；

静置、离心：静置15 min，4 000 r/min离心15 min，取蛋白沉淀；

真空干燥：真空电热干燥箱50℃，干燥12 h。

1.3.2 蛋白含量测定

原料中蛋白含量测定：参照国标GB/T 5511—2008《谷物和豆类氮含量测定和粗蛋白质含量计算凯氏法》[9]，上清液蛋白含量测定：采用双缩脲法[10]。

1.3.3 酶的选择

使用细胞破壁酶和蛋白酶对薏仁米蛋白进行提取，以蛋白提取率为评价指标，选择最佳的提取用酶，在料液比1∶20（g∶mL），加酶量2%[11]，各酶最适宜条件下，恒温水浴2h，85℃灭酶10min，4000r/min离心15min，测定上清液中蛋白含量，计算薏仁米糠蛋白提取率。同时做空白试验，除不加酶外，其他同上。试验所用酶种类及其反应条件如下：

纤维素酶（50 U/mg）最适pH为4.8，最适温度50℃；酸性蛋白酶（50 U/mg）最适pH为3.5，最适温度55℃；中性蛋白酶（100 U/mg）最适pH为7.0，最适温度50℃；碱性蛋白酶（200 U/mg）最适pH为8.0，最适温度55℃；复合蛋白酶（120 U/mg）最适pH为6.0，最适温度45℃。

1.3.4 酶法提取薏仁米糠蛋白单因素试验

确定了酶的种类为碱性蛋白酶后，选取加酶量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL））、酶解pH（7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5）、酶解温度（35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃）、酶解时间（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h）5个因素进行单因素试验，考察不同因素对薏仁米糠蛋白提取率的影响。

1.3.5 响应面优化酶法提取薏仁米糠蛋白

在单因素试验基础上，用Box-Behnken试验设计对各影响因素加酶量、酶解温度、酶解时间、酶解pH进行优化，设计4因素3水平的响应面优化试验，进行全因素响应面分析[12]，因素与水平如表1所示。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.6 计算公式

2 结果与分析

2.1 蛋白酶种类的选择

考察不同蛋白酶对薏仁米糠蛋白提取率的影响，结果如图1所示。由图1可知，未经蛋白酶作用，薏仁米糠蛋白提取率为15.82%，加入各种蛋白酶后，薏仁米糠蛋白提取率明显提高，不同种类蛋白酶对薏仁米糠蛋白提取率影响大小依次为碱性蛋白酶＞纤维素酶＞酸性蛋白酶＞中性蛋白酶＞复合蛋白酶。因此，选取碱性蛋白酶进行后续试验。

图1 不同酶类对薏米糠蛋白提取率的影响Fig.1 Effect of different enzymes on extraction rate of adlay bran protein

2.2 酶法提取薏仁米糠蛋白的单因素试验结果

2.2.1 加酶量对薏仁米糠蛋白提取率的影响

由图2可知，当加酶量0.5%～1.5%时，薏仁米糠蛋白提取率随着加酶量的增加而增加，这应该是随着加酶量的增大，酶与底物接触充分，酶对不溶性蛋白的作用加强，提取率升高；当加酶量为1.5%时，薏仁米糠蛋白提取率最大，为80.41%；当加酶量＞1.5%，薏仁米糠蛋白提取率有所降低，可能是由于过多的酶使蛋白质水解过度，疏水性基团暴露，使得蛋白空间结构改变，蛋白溶解度降低，提取率下降[14]。因此，选择碱性蛋白酶加酶量为1.5%。

图2 碱性蛋白酶添加量对薏仁米糠蛋白提取率的影响Fig.2 Effect of alkali protease addition on extraction rate of adlay bran protein

2.2.2 料液比对薏仁米糠蛋白提取率的影响

图3 料液比对薏仁米糠蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of adlay bran protein

由图3可知，当料液比在1∶10～1∶25（g∶mL）范围内，薏仁米糠蛋白提取率随料液比的增大而增大；当料液比为1∶25（g∶mL）时，薏仁米糠蛋白提取率最大，为65.36%；当料液比＞1∶25（g∶mL）之后，薏仁米糠蛋白提取率随之降低。这可能是因为在料液比较低时，体系黏度较大，流动性差，分子的扩散速率受影响，体系混乱不均匀，阻碍了传质过程，酶作用效果差，蛋白提取率低[15]；当料液比过大时，碱性蛋白酶被稀释，浓度降低，与底物作用几率降低，使蛋白提取率降低。因此，选择酶解料液比为1∶25（g∶mL）。

2.2.3 酶解pH对薏仁米糠蛋白提取率的影响

由图4可知，在pH在7.0～9.5范围内，薏仁米糠蛋白提取率随着pH的增大迅速增大；在pH为9.5时，薏仁米糠蛋白提取率最大，为83.05%；pH＞9.5之后，薏米糠蛋白提取率随着pH的增大而降低。过高或过低的pH都会对蛋白酶活性造成影响，从而使提取率偏低。因此，选择酶解pH值为9.5。

图4 酶解pH对薏仁米糠蛋白提取率的影响Fig.4 Effect of enzymolysis pH on extraction rate of adlay bran protein

2.2.4 酶解温度对薏仁米糠蛋白提取率的影响

图5 酶解温度对薏仁米糠蛋白提取率的影响Fig.5 Effect of enzymolysis temperature on extraction rate of adlay bran protein

由图5可知，在酶解温度为35～55℃时，薏仁米糠蛋白提取率随温度的升高而增大，应该是因为随体系温度的升高，蛋白酶活性增强，对底物的作用随之增强，蛋白提取率增大；当酶解温度为55℃时，薏仁米糠蛋白提取率最大，为64.87%；当酶解温度＞55℃后，薏米糠蛋白提取率呈现降低趋势，可能是随着酶解温度的继续升高，酶活性受到影响，从而导致蛋白提取率降低。因此，选择酶解温度为55℃。

2.2.5 酶解时间对薏仁米糠蛋白提取率的影响

由图6可知，提取时间在1.0～1.5 h内，薏仁米糠蛋白提取率变化平稳，应该是由于时间短，酶与底物未充分接触，使得酶发挥的作用较小；提取时间在1.5～2.0 h内，薏仁米糠蛋白提取率迅速增大，随着时间的进行，酶与底物充分接触，并且体系中未溶出的蛋白质较多，酶促反应底物浓度较大，酶解反应不断进行，蛋白提取率增大；提取时间在2.0 h时，薏仁米糠蛋白提取率最大，为62.57%；提取时间＞2.0 h后，蛋白质得到最大限度的释放，底物不断减少，酶与未溶出蛋白的作用机会减少，蛋白提取率逐渐降低，并且酶解时间过长，酶活性也会受到一定程度的制约。因此，选择酶解时间为2.0 h。

图6 酶解时间对薏仁米糠蛋白提取率的影响Fig.6 Effect of enzymolysis time on extraction rate of adlay bran protein

2.3 酶法提取工艺的响应面优化及方差分析

2.3.1 Box-Benhnken响应面试验

表2 Box-Benhnken试验设计及结果Table 2 Design and results of Box-Benhnken experiments

在单因素试验基础上，选取影响较为明显得4个因素进行响应面优化试验，用Design-Expert软件对试验数据进行多元回归拟合及方差分析[13]，以蛋白提取率（Y）为响应值，试验设计及结果见表2，方差分析见表3。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

用Design-Expert软件对试验数据进行多元回归拟合分析，得料液比（A）、酶解温度（B）、酶解时间（C）、酶解pH（D）的二次多项回归方程为：Y=82.08+1.74A+1.13B-0.44C+ 2.98D-3.79AB-4AC+0.43AD+2.18BC-2.10BD+0.27CD-6.44A2-2.67B2-2.50C2-4.26D2

由表3可知，在本试验所涉及范围内，模型的P值=0.0005，模型极显著，在统计学上有意义；失拟项P值=0.2893＞0.05，失拟项不显著，说明该模型与试验拟合度良好，此方法合理可行。酶解pH影响极显著（P＜0.01），料液比、酶解温度影响显著（P＜0.05）；在交互作用中，料液比、酶解温度交互作用极显著（P＜0.01），料液比、酶解时间交互作用显著（P＜0.05），其他交互作用均不显著（P＞0.05）；二次项中，料液比、酶解pH影响极显著（P＜0.01），酶解温度、酶解时间影响显著（P＜0.05）。

2.3.2 响应曲面分析预测

利用响应面分析对试验因素进行最优化处理，以确定4个因素对蛋白提取率的影响，响应面图见图7。由图7可知，响应面分析图的曲面开口向下，说明二次回归方程存在最大值。由Design-Expert8.0.6软件分析得出提取率最佳工艺条件：料液比1∶28.74（g∶mL），酶解温度50.19℃，酶解时间1.5 h，酶解pH 9.8。在此优化条件下，理论蛋白提取率为83.48%。为了便于实际操作，将优化工艺条件修正为：料液比1∶29（g∶mL），酶解温度50℃，酶解时间1.5 h，酶解pH 9.8。经验证试验，此条件下薏仁米糠蛋白平均提取率为79.66%。

图7 酶解温度、酶解时间、酶解pH和料液比交互作用对蛋白提取率影响的响应面及等高线Fig.7 Response surface plots and contour line of effects of interaction between enzymolysis temperature,time,pH and solid-liquid ratio on extraction rate of adlay bran protein

3 结论

选用碱性蛋白酶，通过酶法提取薏仁米糠中的蛋白质，通过对料液比、酶解温度、酶解时间、酶解pH四个因素的单因素试验确定最佳水平，同时用Design-Expert软件设计试验，通过用Box-Behnken试验设计和响应面分析确定最佳酶法提取工艺为：料液比1∶29（g∶mL），酶解温度50℃，酶解1.5 h，酶解pH 9.8，理论蛋白提取率达83.48%。此优化条件下，平均蛋白质提取率为79.66%，产品纯度达73.42%。

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Optimization of extraction technology of adlay bran protein by enzymatic method

REN Xieke1,3,CHEN Li1,3*,LU Hongmei1,3,GAO Bing4,JIA Qinghui2,3,WANG Zhen1
(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550003,China; 2.College of Chemistry and Chemical Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 3.Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy of Guizhou Province,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 4.College of Bioengineering and Food Science,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

In order to research the optimum extraction technology of adlay bran protein by enzymatic method,on the basis of single factor experiments,the extraction conditions of adlay bran protein were optimized by Box-Benhnken experiments design and response surface methodology.The influence factors on adlay bran protein extraction rate were analyzed by regression equation,and the optimum extraction technology conditions were identified as solid-liquid ratio 1∶29(g∶ml),enzymolysis temperature 50℃,time 1.5 h and pH 9.8.Under the optimum extraction conditions,the average extraction rate of adlay bran protein was 79.66%and purity of the products was 73.42%.

adlay bran protein;extraction;enzymatic method;response surface optimization

TS213

0254-5071（2017）07-0167-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.036

2017-04-27

贵州省科技合作计划（LH[2015]7668）

任勰珂（1992-），女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。

*通讯作者：陈莉（1981-），女，副教授，硕士，研究方向为微生物。