柠檬酸和氯化钠抑制地衣芽孢杆菌生物被膜的研究

侯佳启，林敏，周亚彬，马崇礼，毕旺来*，李睿

（武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023）

柠檬酸和氯化钠抑制地衣芽孢杆菌生物被膜的研究

侯佳启，林敏，周亚彬，马崇礼，毕旺来*，李睿

（武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023）

地衣芽孢杆菌是食品中常见腐败菌。该研究发现地衣芽孢杆菌在常见培养基（如TSB、NB、LB、1/2LB）中均有较强的产生物被膜能力，地衣芽孢杆菌稀释100倍、在胰酪胨大豆肉汤（TSB）培养基中30℃静置培养更利于地衣芽胞杆菌在96孔板上产生物被膜。测得地衣芽孢杆菌对柠檬酸和氯化钠的最低抑菌质量浓度（MIC）分别为1.28 mg/mL和64 mg/mL。采用结晶紫染色法，研究不同质量浓度柠檬酸和氯化钠对地衣芽孢杆菌生物被膜的抑制效果。结果显示，1/2MIC的氯化钠即能显著抑制地衣芽孢杆菌生物被膜形成（P＜0.01）；而1/2MIC和1MIC的柠檬酸对地衣芽孢杆菌生物被膜形成无明显抑制效果（P＞0.05）。

地衣芽孢杆菌；生物被膜；柠檬酸；氯化钠；抑制效果

细菌生物膜（也称生物被膜）是一种定植于物体表面的微生物聚集体，由细菌和自身分泌的胞外基质组成，广泛存在于食品加工厂、污水排放系统等场所[1-2]。细菌生物膜能够提供特殊的微环境和黏质物屏障作用，保护细菌免受外环境侵害，降低各类防腐剂和消毒措施的杀菌抑菌作用[3]。细菌生物膜不仅是细菌耐药的主要原因之一，也能造成细菌在食品加工环境持续生长繁殖，从而导致食品腐败，缩短食品保质期，影响食品安全[4-5]。因此细菌生物膜的防控已成为各国生物和食品学家研究的热门领域之一[6-9]。

地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）属于革兰氏阳性芽孢杆菌，能产生丰富的蛋白和淀粉分解酶，从而使肉、罐头、豆类、淀粉食品等腐败变质。地衣芽孢杆菌耐热性强，抵抗不良环境能力强，因此是食品常见腐败菌[10]。

柠檬酸和氯化钠是食品常见添加剂，这两种添加剂同时还具有一定的抑菌性能[11-12]。陈南南等[13]探究了柠檬酸对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、藤黄微球菌三种腐败菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）；李雅丽等[14]的研究表明，地衣芽孢杆菌对氯化钠不耐受；陈晓等[15]研究了地衣芽孢杆菌对不同防腐剂的敏感性，结果表明地衣芽孢杆菌对山梨酸钾、乳酸钠不敏感，对Nisin、ξ-聚赖氨酸和尼泊金乙酯较为敏感。

地衣芽孢杆菌生物膜的形成机理目前尚未有详细研究。本实验主要研究地衣芽孢杆菌生物膜的形成条件以及柠檬酸和氯化钠对地衣芽孢杆菌生物膜的影响，旨在为食品防腐提供参考，为企业应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验菌株

地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）：由本实验室分离，上海生工生物公司经16S rRNA基因测序鉴定。

1.1.2 实验试剂

氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、十二水磷酸氢二钠、一水合柠檬酸、大豆蛋白胨、葡萄糖、无水乙醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；刀豆蛋白A（FITC-Con A）：美国Vector Laboratories公司；蛋白胨：英国OXOID公司；结晶紫：武汉市华顺生物技术有限公司。

胰蛋白胨大豆肉汤（trypticsoybroth，TSB）培养基、营养肉汤（nutrient broth，NB）培养基、溶菌肉汤（lysogenybroth，LB）培养基、1/2LB、MH肉汤（mueller-hinton broth，MHB）培养基：青岛海博生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

THZ-22型恒温摇床：太仓市实验设备厂；V-1100D型可见分光光度计：上海美普达仪器有限公司；SL302型电子天平：上海民桥精密科学仪器有限公司；UPY-III-103纯水制备成套设备：四川优普超纯科技有限公司；PYX-150S-B生化培养箱：科力仪器有限公司；SW-CJ-IBU超净工作台；SUNRISE酶标仪：英国TECAN公司；COSTAR 96孔细胞培养板：美国Corning公司；ECLIPSE 80i显微镜：尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 地衣芽孢杆菌的产膜条件实验

将地衣芽孢杆菌分别接种到TSB、NB、LB、1/2LB四种培养基中，37℃、150 r/min培养至OD600nm约为1.0，用相应培养基50倍和100倍稀释菌液备用。各取150 μL不同浓度菌液于96孔细胞培养板中，分别于30℃、37℃静置培养72 h，每一实验组和阴性对照组各设置至少3个平行孔，阴性对照组为只加无菌培养基，平行试验3次。用结晶紫染色法测定膜产量。

1.3.2 NaCl和柠檬酸的最小抑菌浓度的测定

将地衣芽孢杆菌接种到MHB培养基中，37℃、150r/min恒温振荡培养至OD600nm约为1.0，50倍稀释菌液备用。配制5.12 mg/mL柠檬酸母液、256 mg/mL氯化钠母液，按参考文献[16]的方法进行系列倍比稀释。取50 μL菌液与50 μL不同浓度的氯化钠或柠檬酸加入96孔细胞培养板中，37℃静置培养24h，并设置阳性对照组（50μL菌液与50μLMHB混合）和阴性对照组（只加100 μL MHB），每一实验组和对照组各设置至少三个平行孔。平行试验3次。

1.3.3 地衣芽孢杆菌生物膜荧光观察

将地衣芽孢杆菌接种到TSB培养基中，37℃、150r/min培养14 h左右，培养至OD600nm约为1.0。用新鲜TSB稀释100倍，即调整菌液浓度为105CFU/mL，备用。在6孔细胞培养板中放置无菌盖玻片，取2 mL菌液转接于6孔细胞培养板，30℃分别静置培养24h、48h、72h。培养结束后，捞出盖玻片，取pH值为7.2的磷酸盐缓冲溶液（phospbatebuffersaline，PBS）洗涤盖玻片上的浮游菌，取200 μL 20 μg/mL FITC-ConA均匀滴加到盖玻片上，37℃条件下遮光处理30 min，用PBS洗涤2次，洗去残液后，荧光显微镜下观察生物膜形态与结构。

1.3.4 氯化钠、柠檬酸对地衣芽孢杆菌生物膜形成的影响

将地衣芽孢杆菌接种到TSB培养基中，37℃、150 r/min培养14h，培养至OD600nm约为1.0。用新鲜TSB稀释50倍，即调整菌液浓度为106CFU/mL，备用。取75μL菌液加入96孔细胞培养板，再分别加入75μL的256mg/mL（4MIC）、128mg/mL（2MIC）、64 mg/mL（MIC）氯化钠，30℃静置培养72 h，并做阳性对照组（75 μL菌液与75 μL TSB混合）与阴性对照组（只加150 μL TSB）。培养完成后，弃菌液，进行结晶紫染色测定生物膜。氯化钠母液用TSB溶解配置。柠檬酸处理方式同上。

1.3.5 结晶紫染色测定生物膜

[17]方法并略有修改。取200μLPBS（pH7.2）洗涤生物膜2次。37℃干燥40min后，每孔中加入200μL0.1%结晶紫，37℃染色15 min，用PBS洗涤2次，干燥。每孔加入200 μL体积分数95%的无水乙醇，静置直至生物膜完全脱色，将染液转移至新的96孔细胞培养板中，在波长600 nm处测量吸光度值，每一实验组和对照组设置至少3个平行对照孔，取平均值。实验进行3次重复。计算公式如下：

样品最终OD值=样品平均OD值-阴性对照OD平均值

2 结果与分析

研究表明，温度、菌液浓度、营养条件是影响微生物生物膜的形成的重要因素[2]，因此本研究分别测定了温度、菌液浓度、培养基种类对地衣芽孢杆菌生物膜形成的影响。

2.1 地衣芽孢杆菌产膜条件

在50倍稀释菌液条件下，考察不同温度条件下地衣芽孢杆菌在不同培养基中产膜能力，结果见图1。

图1 不同温度条件下地衣芽孢杆菌在不同培养基中产生物被膜能力比较Fig.1 Comparison of the biofilm formation ability ofB.licheniformis in different mediums and temperature

由图1可知，在30℃条件下，TSB、NB、LB、1/2LB四种培养基中地衣芽孢杆菌产生的生物膜量均高于37℃条件下的生物膜量。

在30℃条件下，考察不同菌液浓度时地衣芽孢杆菌在不同培养基中产膜能力，结果见图2。

图2 不同菌液浓度下地衣芽孢杆菌在不同培养基中产生物被膜能力比较Fig.2 Comparison of the biofilm formation ability ofB.licheniformis in different mediums and concentrations of bacterial solution

由图2可知，地衣芽孢杆菌100倍稀释菌液（100*表示）在TSB、NB、1/2LB培养基中产生的生物膜量均高于50倍稀释菌液（50*表示），LB培养基恰好相反。

在30℃、100倍稀释菌液条件下，考察不同培养基对地衣芽孢杆菌产膜能力的影响，结果见图3。

图3 不同培养基对地衣芽孢杆菌产生物被膜能力的影响Fig.3 Effect of different mediums on the biofilm formation ability of B.licheniformis

由图3可知，地衣芽孢杆菌在TSB、NB、LB、1/2LB四种培养基中均有较强的产膜能力，地衣芽孢杆菌在LB培养基中产膜最弱。

因此，本实验最终确定的地衣芽孢杆菌产膜条件为：地衣芽孢杆菌起始菌液浓度105CFU/mL左右（即将培养至OD600nm值约为1.0的地衣芽孢杆菌稀释100倍），TSB培养基中30℃静置培养。

2.2 氯化钠和柠檬酸的MIC测定

按2012 CLSCI抗菌药物敏感性试验执行标准测定MIC，通过二倍稀释法得出，氯化钠对地衣芽孢杆菌的最低抑菌浓度为64 mg/mL，柠檬酸对地衣芽孢杆菌的最低抑菌浓度为1.28 mg/mL。

2.3 地衣芽孢杆菌生物膜荧光观察

地衣芽孢杆菌在TSB中培养24 h，经FITC-Con A染色后用荧光显微镜观察，可见盖玻片表面有绿色絮样、不定形团块，即为地衣芽孢杆菌早期生物膜。48 h、72 h后的生物膜量明显增多，形成更为密集、体积更大的团块状、絮样结构，玻璃表面的透光度明显降低，生物膜的结构更为致密。

2.4 氯化钠、柠檬酸对地衣芽孢杆菌生物膜的抑制作用

将地衣芽孢杆菌稀释菌液与不同含量的氯化钠或柠檬酸混合，加入96孔细胞培养板，使柠檬酸、氯化钠终浓度约为1/2MIC、MIC、2MIC。30℃静置培养72 h，地衣芽孢杆菌可在细胞培养板孔的侧壁和气液交界面上均形成肉眼可见的膜。用吸头轻轻去掉气液交界面上漂浮的膜和菌液，将粘附在孔侧壁上的生物膜洗涤烘干，用结晶紫法测定生物膜量。

图4不同氯化钠质量浓度对地衣芽孢杆菌生物被膜抑制效果Fig.4 Inhibitory effects of different concentrations of sodium chloride onB.licheniformisbiofilm

图4 可见，各样品组的OD600nm值与对照组比较，均出现了极显著差异（P＜0.01），表明1/2MIC的氯化钠（32mg/mL）即能显著抑制地衣芽孢杆菌生物膜形成。

2.4.2 柠檬酸抑制地衣芽孢杆菌生物膜形成的影响结果

图5 不同柠檬酸质量浓度对地衣芽孢杆菌生物被膜抑制效果Fig.5 Inhibitory effects of different concentrations of citric acid on B.licheniformisbiofilm

由图5可见，各样品组的OD600nm值与对照组比较，仅2.56mg/mL（2MIC）柠檬酸组出现了极显著差异（P＜0.01），表明加入较高浓度的柠檬酸能显著抑制地衣芽孢杆菌生物膜的生成，而1/2MIC和MIC的柠檬酸对地衣芽孢杆菌生物膜形成无明显抑制效果（P＞0.05）。

3 结论

本试验研究了地衣芽孢杆菌生物膜最适生长条件，以及柠檬酸和氯化钠对地衣芽孢杆菌生物膜的抑制效果。研究结果表明，地衣芽孢杆菌产膜能力很强，在营养丰富的培养基如TSB、LB，营养简单的培养基如NB、1/2LB上均能产生肉眼可见的生物膜。低温（30℃）比高温（37℃）更有利于地衣芽孢杆菌产生物膜。结果显示低于最低抑菌浓度的氯化钠即能有效抑制地衣芽孢杆菌生物膜的形成，低于最低抑菌浓度的氯化钠有可能通过减少细菌运动性能、减少细菌附着到固定载体上，从而抑制地衣芽孢杆菌形成生物膜[2]；1/2MIC和MIC的柠檬酸对地衣芽孢杆菌生物膜形成无明显抑制效果，说明高浓度的柠檬酸主要通过抑制细菌生长、减少细菌数目，从而减少生物膜产生。

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Inhibitory effects of citric acid and sodium chloride onBacillus licheniformisbiofilm

HOU Jiaqi,LIN Min,ZHOU Yabin,MA Chongli,BI Wanglai*,LI Rui
(College of Biological and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China)

Bacillus licheniformisis a common spoilage bacterium in food.This studly showed thatB.licheniformisall had strong biofilm formation ability in the common medium(including TSB,NB,LB and 1/2LB).The bacterial solution ofB.licheniformiswas diluted 100 times and was cultured in the tryptic soytone broth(TSB)medium at 30℃,which was more beneficial to the formation ofB.licheniformisbiofilm on the 96-well plate.The minimum inhibitoryconcentration(MIC)ofB.licheniformison citric acid and sodium chloride were 1.28 mg/ml and 64 mg/ml,respectively.By crystal violet staining,the inhibitory effect of different concentration of citric acid and sodium chloride onB.licheniformisbiofilm was researched.The results showed that 1/2MIC sodium chloride could significantly inhibit the formation ofB.licheniformisbiofilm(P＜0.01),while 1/2MIC and 1MIC citric acid had no significant inhibitory effect on the formation ofB.licheniformisbiofilm(P＞0.05).

Bacillus licheniformis;biofilm;citric acid;sodium chloride;inhibitory effect

R155.5

0254-5071（2017）07-0110-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.024

2017-02-21

企业委托项目（2016）；武汉轻工大学大学生科研创新项目（2016）

侯佳启（1995-），男，本科生，研究方向为食品微生物。

*通讯作者：毕旺来（1972-），男，实验员，本科，研究方向为食品微生物。