广州白云机场口岸入境海鱼感染异尖线虫鉴定研究

黄燕琼，张 森，何淑华，姚静雯，戴 金，邓 艳，柏建山

（1.广州机场出入境检验检疫局国家水产品检测重点实验室，广东 广州 510470；2.华南理工大学食品学院，广东 广州 510640）

广州白云机场口岸入境海鱼感染异尖线虫鉴定研究

黄燕琼1，张 森2，何淑华1，姚静雯1，戴 金1，邓 艳1，柏建山1

（1.广州机场出入境检验检疫局国家水产品检测重点实验室，广东 广州 510470；2.华南理工大学食品学院，广东 广州 510640）

对2012—2015年从白云机场口岸入境的214批海鱼进行剖检鉴定异尖线虫，取内脏和鱼肉进行酶消化，在10批次海鱼中分离出虫体，用苯酚乳酸透明液进行透明处理及形态学鉴定，确定所分离出的虫体有异尖线虫三期幼虫I型和Ⅱ型。用线虫rDNA ITS区通用引物NC5和NC2对虫体进行PCR扩增，并对虫体的核糖体基因间隔区ITS1和ITS2进行序列和进化分析，确定分离出来的异尖线虫三期幼虫包括简单异尖线虫（Anisakia simple）、抹香鲸异尖线虫（Anisakia physeteris）和典型异尖线虫（Anisakia typica）。调查结果对公共安全的风险评估有重要意义，同时为口岸的进境水产品食品安全风险评估提供参考数据。

异尖线虫；形态学鉴定；PCR扩增；序列分析

异尖线虫成虫寄生于海洋哺乳类动物的消化道内，幼虫则广泛寄生于不同品种的海鱼体内［1］。如果人食用生的或未熟的含有异尖线虫幼虫的海鱼，如寿司、生鱼片等，则可引起异尖线虫病，感染的异尖线虫幼虫可以钻入消化道，或移行到其他组织，从而引起人的急腹症症状，如剧烈腹痛、恶心、呕吐、腹泻等［2-4］。近年来，随着生食海鲜鱼类的饮食习惯日渐流行，异尖线虫病对人类健康构成严重危害，已成为影响我国海产品食用安全性的重要危害因素之一。目前，已报道的全球感染异尖线虫病病例达3万余例，仅日本就有2万人感染此病，且以每年2 000多例的速度递增［5］。异尖线虫病是重要的人兽共患寄生虫病，被我国列为禁止入境的二类寄生虫病。

异尖属线虫隶属于蛔目异尖科，能引起人类异尖线虫病的主要有4个属，分别为异尖线虫属、对盲囊线虫属、宫脂线虫属和伪地新线虫属。异尖线虫病主要是由异尖属线虫的第三期幼虫引起的，包括简单异尖线虫（Anisakia simple）、抹香鲸异尖线虫（Anisakia physeteris）和典型异尖线虫（Anisakia typica）3种［6］。异尖属线虫的成虫和幼虫广泛分布在世界各大海域，据报道已有20多个国家100多种鱼类感染异尖属线虫［7-9］。葛卜峰等［10］对在南通口岸进境的来自150个国家和地区的78批共255尾海鱼进行了异尖属线虫幼虫检验，其中有100尾海鱼检出异尖属线虫幼虫感染，共检出幼虫1 554条。我们对2012—2015年从白云机场口岸入境的214批海鱼进行异尖线虫感染情况调查和鉴定研究，为口岸进境水产品的食品安全风险评估提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源 调查样本为2012—2015年白云机场口岸从36个国家和地区入境的整条带内脏的海鱼，不同种类，共214批，每批海鱼数为1～40条不等。

1.1.2 主要仪器 生物显微镜（L e c i a DM5000B）、体视显微镜（Lecia S8APO）、恒温振荡器（T H Z-D）、冷冻离心机（Siama 3K15）、梯度PCR仪（BIOMETRA TRRADIENT） 、电泳仪（BIA-RAD、PowerPac Basic）、凝胶成像系统（VILBER）、手术刀、小镊子、昆虫针、载玻片、盖玻片。

1.1.3 主要试剂 8.5 g/L生理盐水、胃蛋白酶-浓盐酸消化液、酒精、乳酸-酚-甘油混合透明液，试剂配制方法参照《异尖线虫病诊断规程》和《鱼类简单异尖线虫幼虫检测方法》。TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit试剂盒、Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒、Plasmid Purification Kit Ver.4.0试剂盒、10 ×PCR buffer、dNTP、Taq酶、pMD18-T载体、DH5α感受态细胞，购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 虫体样本分离 剖开海鱼的内脏和肌肉，肉眼检查海鱼腹腔、内脏、肠系膜和肌肉组织，观察有无虫体和包囊。发现有虫体或包囊的，用昆虫针和镊子剔除包囊和周围杂质，把虫体分离出来。肌肉和内脏仍可能有肉眼未观察到的虫体，将肌肉和内脏用消化液进行消化，料液比按1∶10配制后，于恒温振荡器内，37℃、150 r/min放置4～5 h使其充分消化后，将消化液滤过孔径2.0 mm的筛，吸去上清液，搅拌后沉淀20～30 min，再吸去上清液，用生理盐水反复清洗几次，直至上清液透明为止，分离出虫体，置于有生理盐水的培养皿中。

1.2.2 虫体形态学鉴定 用体视显微镜观察，疑似异尖线虫幼虫的虫体呈乳白色，在生理盐水中卷曲或有包囊包住，体长约10～30 mm，将部分虫体放入苯酚-乳酸-甘油透明液中进行透明处理后置于载玻片上，盖上盖玻片在生物显微镜下观察，参照《异尖线虫病诊断规程》进行鉴定。异尖属幼虫：虫体头部顶端有一钻孔齿，Ⅰ型幼虫肠腔呈Y型，胃长，尾短，尾端有棘；Ⅱ型幼虫胃短，尾长，尾端无棘，肠腔呈Y型或Ⅰ型。观察鉴定后将虫体放入装有75%酒精的离心管中放-20℃保存。

1.2.3 虫体DNA提取 将单条虫体从75%酒精的离心管中取出 ，置于灭菌的1.5 mL 离心管中，用纯水洗净后用研磨棒研磨，后根据TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit试剂盒的步骤提取虫体基因组DNA。将基因组DNA置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.4 PCR扩增 引物为异尖科线虫ITS序列的通用引物，上游引物NC5（5′GTAGGTGA ACCTGCGGAAGGATCATF3′），下游引物NC2（5′TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT3′）［11］，由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。以NC5、NC2引物扩增ITS序列片段，扩增体系为25 μL：2.5 μL 10×PCR buffer，2.5μL Mg2+，1 μL dNTP，1 μL NC5引物，1 μL NC2引物，0.5 μLTaq酶，1 μL DNA模板，用超纯水补足至25 μL。反应程序为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，30个循环；最后72℃延伸10 min。取反应产物5 μL在1%琼脂糖凝胶中进行电泳20 min，在凝胶成像系统中观察并拍照记录结果。

1. 2. 5 扩增片段的克隆和测序 使用Takara公司的Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒，按照说明书步骤进行PCR扩增片段的纯化回收，将纯化产物连接到pMD 18-T载体上，然后转化至感受态细胞DH5α中培养，将DH5α感受态细胞培养液涂布到含有氨苄青霉素、IPTG、X-gal的LB琼脂平板上，37℃恒温培养箱中培养12 h，再进行蓝白斑筛选（方法参照《分子克隆实验指南》第3版），挑取单个白色菌落，按照Takara公司的Plasmid Purification Kit Ver.4.0试剂盒说明书步骤进行质粒提取。将质粒置于-20℃冰箱保存。

1.2.6 构建系统进化树 将阳性克隆质粒送英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序，测序获得的序列经校正处理后使用NCBI的BLAST在线工具（ http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi）进行序列比对，为了进行系统进化分析，于GenBank 中获取以下各虫种的ITS1、5.8S、ITS2基因序列，包括：简单异尖线虫（Anisakis simplex登录号为JN005757、A. pegreffii登录号为JN005768、A. simplex‘C’ 登录号为AY826722）、典型异尖线虫（A. typical登录号为KC928262）、短棘异尖线虫（A. brevispiculata，登录号为AY826719）、剑吻鲸异尖线虫（A. ziphidarum登录号为JN005766）、抹香鲸异尖线虫（A. physeteris登录号为AY826721）、小抹香鲸异尖线虫（A. paggiae登录号为GU295974）、A. nascettii（A. nascettii登录号为JQ912692）、内弯宫脂线虫（Hysterothylacium aduncum登录号为AB277826）。将测序结果与下载的ITS序列用ClustalX软件进行差异性分析，并进行必要调整，然后用MEGA5.0（Molecular Evolutionary Genetic Analysis 5.0 version）软件，使用最大似然法M-L法构建系统发生树，自展值重复1 000次。

2 结果与分析

2.1 不同种类海鱼异尖线虫感染情况

本研究对2012—2015年白云机场口岸进境的214批海鱼进行剖检，每批海鱼数1～40尾不等，其中有10批次的海鱼剖检出感染异尖线虫三期幼虫（图1，封三）。10批次海鱼有63尾，感染异尖线虫阳性的有59尾，阳性率为93.7%；检获异尖线虫幼虫817条，平均感染强度13.8条，对每一批次的1～2条虫体进行编号，如表1所示。

2.2 形态学鉴定结果

经苯酚-乳酸-甘油透明液透明后，在生物显微镜下对虫体进行形态学观察，10种海鱼感染异尖线虫三期幼虫。AN1、AN3、AN4、AN5、AN6、AN7、AN9、AN10、AN11在镜下的形态基本一致，虫体不易透明，体表具有明显的角质环纹。虫体头部钝圆，顶端口近似三角形，有一钻齿（图2A，封三），食道前端细，向后逐渐膨大，胃黑色而不透明，胃长、柱形，与肠以斜线相连（图2B，封三）。尾短，周围有很多横纹，顶端有一尾图，呈圆塔形（图2C，封三），鉴定为异尖线虫幼虫Ⅰ型；AN2、AN8在镜下的形态基本一致，虫体不易透明，体表具有明显的角质环纹。头部钝圆，顶端有一钻齿，其尖端的下方有一长圆形的孔，为排泄孔（图3A，封三）。胃短，柱形，与肠交界处呈一曲面（图3B，封三）。尾长，呈圆锥形，周围的横纹较少，尾端无棘（图3C，封三），鉴定为异尖线虫幼虫Ⅱ型。

2.3 ITS序列PCR扩增结果

以编号为AN1～AN11的线虫基因组DNA为模板，使用异尖线虫ITS通用引物NC5、NC2进行PCR扩增，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。10种海鱼感染的异尖线虫均能扩增出ITS序列片段，得到大小为1 000 bp左右的片段，与预期片段大小相符（图4）。

图4 10种海鱼感染的异尖线虫ITS序列的PCR扩增结果

2.4 序列比对分析结果

样品测序结果经Blast分析比对，AN1、AN3、AN4、AN6、AN7、AN9的ITS序列与GenBank中已知的简单异尖线虫（A. simplexs.s）相应基因序列（GenBank上登录号为JN005757）同源性达99%～100%；样品AN5与派氏异尖线虫（A. pegreffii）同源性达100%（GenBank上登录号为JN005768）；样品AN2和AN8的序列比对结果与抹香鲸异尖线虫（A. physeteris）同源性达100%（GenBank上登录号为KP313727）；样品AN10和AN11与典型异尖线虫（A. typica）同源性达99%（GenBank上登录号为KC928262）。

2.5 系统进化树构建结果

对10个样品的ITS序列进行多重比对后，进行必要的调整，经M-L法构建系统发生树，从系统进化树拓扑图（图5）可以看到，异尖线虫属构成一个拓扑结构，AN1、AN3、AN4、AN6、AN7、AN9与A. simplexs.s构成自展值为93%的独立分支，AN5与派氏异尖线虫构成自展值为90%的独立分支，以上两个分支又与A. simplexC构成一个自展值为99%的分支；AN2和AN8与抹香鲸异尖线虫构成自展值为100%的独立分支，又与短棘异尖线虫构成一个自展值为99%的拓扑结构分支，AN10和AN11与典型异尖线构成自展值为100%的独立分支。

3 讨论

图5 基于ITS序列与以最大似然法构建的系统进化树

本次调查研究的样本来自36个国家和地区，涵盖大西洋、太平洋和印度洋，具有代表性。调查结果与其他学者的调查研究相符合，如简单异尖线虫多分布在中高纬度地区［12-13］，而本次调查中来自新西兰、加拿大、塞班、中国台湾的样本多为简单异尖线虫；典型异尖线虫广泛分布于热带地区［14-15］，来自孟加拉和澳大利亚的样本多为典型异尖线虫；抹香鲸异尖线虫则来自于加拿大和新西兰的样本，丰富了抹香鲸异尖线虫地理分布的数据。不同品种海鱼的感染率也各不相同，鲷鱼、石斑鱼、比目鱼、鲳鱼等的感染率较高，与本次调查的结果相符，同时在马鲛鱼、红鱼、金枪鱼、珍鲹鱼、鲥鱼体内发现了异尖线虫的存在。

异尖线虫虫体较大，体壁厚，活体时在水中作波浪形运动，较其他线虫活跃。大多数可以从外观与其他线虫区分开。但异尖线虫种内以形态特征来鉴定线虫幼虫是很困难的，往往只能鉴定到属。1961年Berland［16］首次将异尖属线虫幼虫分为Ⅰ型和Ⅱ型两个型。1968年Otsuru等［17］报道了Ⅲ型幼虫的存在，描述Ⅲ型幼虫和Ⅰ型幼虫形态上的区别只是胃长短的区别。但本研究在做异尖线虫幼虫形态鉴定的时候，发现Ⅲ型幼虫和Ⅰ型幼虫在形态上很难区分。因此，本研究采用了先用形态学鉴定做筛查，后结合分子生物学检测和序列分析的方法，该方法更能迅速、准确和特异地鉴定异尖线虫。

本次调查研究中，10批海鱼感染了异尖线虫三期幼虫，其中包括5批次A. simplexs.s.和1批次派氏异尖线虫，而这两种简单异尖线虫幼虫是人类异尖线虫病的最主要病原，说明进口的海鱼中存在使消费者患异尖线虫病的风险。尽管烹饪和冷冻可以使异尖线虫虫体死亡，但此方法不能破坏虫体的过敏蛋白［18］，从而存在着广泛的致过敏反应，需要消费者提高警惕。近年，随着国内生食鱼肉的风气越来越盛，感染异尖线虫病的风险也在急剧增加，因此，口岸应该加强对来自异尖线虫高感染率海域和易感鱼种的进境风险评估，并提高进境口岸样品抽查检测力度，为人民群众的身体健康保驾护航。

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（责任编辑 崔建勋）

Identification on the infection of Anisakis from marine fishes imported by Baiyun Airport

HUANG Yan-qiong1，ZHANG Sen2，HE Shu-hua1，YAO Jing-wen1，DAI Jin1，DENG Yan1，BAI Jan-shan1
（1.State Key Testing Laboratory of Aquatic Products，Guangzhou Airport Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Guangzhou 510470，China； 2.School of Food Science and Technology，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

214 batches of marine fish imported in 2012-2015 from Baiyun Airport in Guangzhou were examined forAnisakislarvae by dissection and digest. 10 batches ofAnisakislarvae were isolated from marine fishes by enzymatic degradation. SomeAnisakislarvae isolated from imported marine fish were identified via morphology as the third larvae ofAnisakisType I and the rest were identified as the third larvae ofAnisakisType Ⅱ. Sequencing and phylogenetic analysis of the ribosomal internal transcribed spacer （ITS） gene identified nematodes asA. simplex，A. physeterisandA. typica. The study has an important impact on the public health risk assessment，and also provides the reference for food safety risk assessment of imported marine fish and aquatic products.

Anisakis； morphological identification； PCR amplification； sequence analysis

S851.34+5.2

A

1004-874X（2017）04-0146-06

黄燕琼，张森，何淑华，等.广州白云机场口岸入境海鱼感染异尖线虫鉴定研究［J］.广东农业科学，2017，44（4）：146-151.

2017-02-23

广东省科技厅科技专项（2014A040401063）

黄燕琼（1979-），女，兽医师，E-mail：1012502668@qq.com

柏建山（1976-），男，博士，高级兽医师，E-mail：57205984@qq.com