不同产地防己药材HPLC指纹图谱的研究

李全生，张正杰，杨世海

（吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118）

不同产地防己药材HPLC指纹图谱的研究

李全生，张正杰，杨世海

（吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118）

建立防己药材的高效液相色谱指纹图谱，为评价及有效控制其质量提供参考。利用HPLC方法，测定了14个不同产地防己药材样品，选用Ultimmate XB C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇（A）- 0.1%甲酸（B），设定流速0.8 mL/min、柱温30℃、检测波长282 nm。采用国家药典委员会的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”进行评价，并对各产地防己药材进行聚类分析。结果表明，14个产地防己药材的HPLC指纹图谱有9个共有峰，所有产地指纹图谱相似度均在0.9以上，不同产地防己质量相似性较好。

防己；产地；高效液相色谱法；指纹图谱；聚类分析

防己为防己科植物粉防己Stephania tetrandraS.Moore的干燥根，最早记载于《神农本草经》中，分属于中品，名曰“解离”，具有利水消肿、祛风止痛的作用。目前，粉防己为常用的重要中药，具有解热镇痛、风湿止痛、利尿消肿之功效，主要用于治疗水肿鼓胀、湿热脚气、手足挛痛、癣疥疮肿、高血压等症［1-2］。野生防己生于山野丘陵地、草丛或矮林边缘下，一般生长5～10年能起挖，采挖后自我恢复能力弱。防己完全依靠野生资源供应市场，近几年由于防己持续高价，大量的粉防己被无序地狂采乱挖，造成防己药材质量出现变化。因此对不同产地防己药材的质量进行分析，明确产地间药材的差异，为防己药材人工种植提供优选种质资源十分必要。在质量控制上，常以组织学和薄层色谱法为手段，通过描述显微特征以及检测粉防己碱和防己诺林碱的TLC斑点达到鉴别粉防己药材基源的目的，再用HPLC方法测定粉防己药材中粉防己碱的含量来控制粉防己药材的质量，限定其含量不得低于1.6%［3］。中药指纹图谱建立在中药化学成分系统研究的基础上，是一种可量化的综合鉴定手段，目前广泛用于中药材以及中药制剂半成品质量的控制与评价上［4-8］。

本试验采用HPLC法，研究并建立防己药材的指纹图谱，并对不同产地的防己药材进行比较研究，以期明确各产地防己药材的质量，为防己药材的鉴别和质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的防己药材样品由吉林农业大学杨世海教授鉴定为防己药材正品。样品编号为S1～S14，产地分别为浙江常山、兰溪、余潜、金华，湖北阳新、黄石，安徽黄山、安庆、徽州、宁国，江西永丰、上饶、信丰、宜春。

粉防己碱对照品（纯度9 8%，批号111637-201308）、防己诺林碱对照品（纯度98%，批号100416-201506）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、甲酸、盐酸均为分析纯，购自北京化工厂；色谱甲醇和乙腈均为色谱纯，购自美国Fisher公司，试验用水为超纯水。

试验主要仪器包括Dionex Uitimate 3000型高效液相色谱仪（美国Dionex公司）、AB265-S型双量程电子天平（瑞士Mettler公司）、Milli-Q纯水机（美国Millipore公司）、SB25-12DT型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 对照品溶液的制备 分别取粉防己碱对照品、防己诺林碱对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成浓度为0.5 mg/mL的溶液，各量取1 mL置于5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成各含100 μg/mL的混合对照品溶液。

1.2.2 供试品溶液的制备 取过3号筛的防己粉末0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入2 mL浓氨水润湿，再加入甲醇25 mL，水浴回流提取60 min，放冷，过滤，蒸干滤液，残渣加适量甲醇溶解，定容至10 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液。

1.2.3 测定方法 分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录 60 min的色谱图。色谱条件：Ultimmate XB C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相甲醇（A）- 0.1%甲酸（B）梯度洗脱（0～10 min，5%～15% A；10～25 min，15%～30% A；25～45 min，30%～53% A；45～60 min，53%～20% A），流速0.8 mL/min，柱温 30℃，检测波长282 nm，进样量10 μL，所有组分均在60 min内被洗脱。

2 结果与分析

2.1 指纹图谱的方法学考察

2.1.1 精密度 取同一批样品（样品S1），按供试品溶液制备方法制成供试品溶液，连续进样6次，测定并记录指纹图谱，结果表明各色谱峰的相对保留时间RSD均＜1%，相对峰面积RSD均＜5%。符合指纹图谱要求，表明仪器精密度良好。

2.1.2 重复性 取同一样品（样品S1），平行制备6份供试品溶液，连续进样6次，测定并记录指纹图谱，结果表明各色谱峰的相对保留时间RSD均＜0.5%，相对峰面积RSD均＜3.2 %，有较高的相似度，重现性良好。

2.1.3 稳定性 取同一样品（样品S1），制备的供试品溶液分别在0、2、4、12、18、24 h进样，测定并记录指纹图谱，结果表明各色谱峰的相对保留时间RSD均＜0.3%，相对峰面积RSD均＜2.0%，说明供试品溶液中成分在24 h以内稳定。

2.2 防己药材指纹图谱共有模式的建立及部分共有峰的标定

将14个样品的指纹图谱导入国家药典委员会的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004A版）”，生成指纹图谱共有模式，其中共有峰9个，且共有峰的峰面积占总峰面积的90%以上，符合指纹图谱技术要求。通过与混合对照品对比分析，确定6号峰为防己诺林碱，7号峰为粉防己碱（图1）。

2.3 不同产地防己药材指纹图谱相似度比较

采用平均矢量法对14个不同产地防己药材指纹图建立共有模式，作为对照指纹图谱，将每张指纹图谱与其进行比较，并计算各个样本与基准样本的夹角余弦和相关系数，得到各图谱与对照指纹图谱的相似度，分析结果见表1～表3。14个产地防己药材指纹图谱的相似度良好，均在0.90以上（表3），说明大多数产地的防己药材质量具有很高的一致性。

图1 14个不同产地防己药材及对照的高效液相指纹色谱图

2.4 各产地防己药材的指纹图谱聚类分析

应用Spass 19.0分析软件，以14批防己药材的9个共有峰的峰面积为指标，构造14×9的原始数据矩阵，采用离差平方和法，利用欧氏距离作为样品的测度对其进行聚类分析［9-10］，结果（图2）表明，通过9个指标性成分可将14个产地的防己药材分为4大类：第一类包括浙江金华、江西宜春，第二类包括浙江余潜、江西信丰、浙江常山、江西永丰、安徽徽州、安徽宁国，第三类包括浙江兰溪、江西上饶、安徽安庆、湖北黄石，第四类包括湖北阳新及安徽黄山。聚类分析结果和指纹图谱相似度结果相似。

表1 不同产地防己药材共有峰相对保留时间（s）

表2 不同产地防己药材共有峰相对峰面积

表3 不同产地防己药材指纹图谱相似度

图2 不同产地防己药材的指纹图谱聚类结果

3 结论与讨论

本试验在防己药材的指纹图谱分析中比较了Ultimmate XB C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Agilent Eclipse XDB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），结果表明，前者的分离度较好，谱峰信息丰富，保留时间适中，因此选Ultimmate XB C18色谱柱作为防己药材的HPLC指纹图谱检测色谱柱。在波长选择上，应用二极管阵列检测器（DAD）对200～400 nm的波段进行紫外扫描，结果发现各组分在检测波长280 nm处有最大吸收，色谱信息丰富，基线基本平稳，故波长选择280 nm为检测波长。同时，比较了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱，最终确定甲醇（A）- 0.1%甲酸（B）流动相系统梯度洗脱分离度好，峰型对称，稳定性好。在柱温的选择上，选择了30、35、40℃ 3种柱温进行筛选，结果表明，随着柱温的升高，色谱峰的保留时间略微提前，总体上观察，兼顾所有色谱峰的分离情况，最终选择柱温为30℃。在流速的选择上，分别比较了0.8、1.0、1.2 mL/min 3种流速，按照乙腈-水的色谱条件进样并记录色谱图。结果表明，流速为0.8 mL/min时，各色谱峰分离度较好，故选用0.8 mL/min的流速。

防己药材为我国大宗型常用药材，在2015版中国药典一部中有11个制剂含有防己药材，其功效作用涉及较广［1］。研究表明，粉防己含有丰富的双苄基异喹啉类生物碱，是粉防己的主要活性成分。该类成分具有显著的药用价值，能够祛风止痛，清热解毒。粉防己的干燥根中含有1.2%生物碱，李行诺等［11］分离鉴定出粉防己碱（Tetrandrine，汉防己甲素）、防己诺林碱（Fangchinoline，汉防己乙素）、氧化防己碱（oxofangchirine）、粉防己碱D盐酸盐（fenfangjine Dhydrochioride）、荷苞牡丹碱〔（+）-dicenrine）〕等。Si等［12］首次从粉防己中分离得到黄酮类化合物。同时，在粉防己植物的根中分离得到黄酮苷、有机酸、挥发油、酚类及糖类等物质。研究表明，防己诺林碱及防己碱为主要有效成分［13-14］，2015版药典也以这两种成分为含量测定指标。巩江等［15］采用GCMS技术，研究发现汉防己挥发油的主要成分是2-甲氧基-4-乙基-苯酚（19.58%）、环己酮（13.07%）、3，7，11-三甲基-1，6，10-十二碳三烯-3-醇（10.01%）、2，2-二羟基-苯并咲喃（3.96%）。吴慧勤等［16］在广防己中研究发现了对流感病毒有明显抑制作用的β-古芸稀。

本研究首次对防己药材 HPLC指纹图谱进行了相似度评价和主成分聚类分析，通过对比不同产地防己指纹图谱的相似度发现，14个产地防己药材的HPLC指纹图谱相似度均在0.9以上，其化学成分相同，说明其种质稳定，未受到种植环境的影响，但共有峰的相对峰面积有所差异，说明有效成分含量受地域影响，产生差异。采用9个共有峰峰面积进行聚类，聚类结果未将相同产地的药材聚为一类，说明不同产地化学成分虽有差异，但这种差异还不能将该产地药材完全独立出来，且可更明显地看出防己药材的化学成分受到环境的影响较小。通过指纹图谱结合聚类分析可较好地对各产地防己药材的质量进行初步评价，对防己药材的合理栽培和产地的科学规划提供参考。

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（责任编辑 崔建勋）

HPLC fingerprint analysis of Fangji from different habitats

LI Quan-sheng，ZHANG Zheng-jie，YANG Shi-hai
（College of Chinese Medicinal Materials，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

To estimate HPLC fingerprint of Fangji for evaluating the differences of chemical composition from different habitats，and provide a reference for evaluating the quality of Fangji，the fingerprints of 14 batches of Fangji from different places were determined by HPLC method. The Ultimmate XB C18column （250 mm × 4.6 mm，5 μm）with methanol （A） - 0.1% formic acid-water （B） as mobile phase was used，the flow-rate was set at 0.8 mL/min，the column temperature was set at 30℃ and the detecting wavelength was set at 282 nm. The fingerprints were compared for similarity by using “Traditional Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System”（2004A） issued by Chinese Pharmacopoeia commission and cluster analysis. The result showed that 9 common fingerprint peaks were identified from 14 habitats of Fangji，and the similarity of all fingerprints was above 0.9，which showed the quality of Fangji from different habitats was good in similarity.

Fangji；habitat；HPLC；fingerprint；cluster analysis

R282.5

A

1004-874X（2017）04-0125-06

李全生，张正杰，杨世海. 不同产地防己药材HPLC指纹图谱的研究［J］.广东农业科学，2017，44（4）：125-130.

2017-02-23

吉林省科技发展计划重大项目（20126046）

李全生（1990-），男，在读硕士生，E-mail：liquanshengmail@163.com

杨世海（1962-），男，博士，教授，E-mail：jlyangs@163.com