超高效液相色谱法测定羊栖菜中岩藻甾醇的含量

刘春平，王 韦，程 卓，赵 琳，黄 雪，卢延斌

(浙江工商大学海洋食品研究院，杭州310012)

超高效液相色谱法测定羊栖菜中岩藻甾醇的含量

刘春平，王 韦，程 卓，赵 琳，黄 雪，卢延斌*

(浙江工商大学海洋食品研究院，杭州310012)

采用超高效液相色谱法测定羊栖菜中岩藻甾醇的含量。羊栖菜试样(2.000 0 g)经甲醇-二氯甲烷(1+1)混合液提取，所得提取液以YMC-Pack ODS-A色谱柱为分离柱，以甲醇-乙腈(3 +7)混合液为流动相，在检测波长210 nm处进行测定。岩藻甾醇的质量浓度在0.5～400 mg· L－1内与其对应的峰面积呈线性关系，检出限(3S/N)为0.16 mg·L－1。在25，50，100 mg·L－1等3个浓度水平进行加标回收试验，回收率在91.2%～96.8%之间。测定值的日内及日间相对标准偏差(n=6)分别在1.1%～5.4%，2.8%～7.0%之间。

超高效液相色谱法;羊栖菜;岩藻甾醇

羊栖菜隶属褐藻门马尾藻科，是一种暖温带-亚热带性海藻，适宜生长在海水透明度较高、营养盐量丰富的海域。在日本，羊栖菜被冠以“海上参”及“长寿菜”的称号，身价为海带的数倍。除了作为食材，羊栖菜已被《中国药典》收藏为药用［1］，并且成功地应用到调味品、休闲食品、保健食品以及相关的药品等产业［2-3］。目前伴随着海洋生物资源的开发热潮，羊栖菜凭借营养价值高以及富含生物活性物质等优点必将引起研究人员的高度重视。

岩藻甾醇是一种重要的生物活性物质，在羊栖菜中含量较低。有报道以80%(体积分数)乙醇溶液对羊栖菜进行回流浸提后，用分光光度法测得岩藻甾醇的质量分数为0.34%［4］。研究表明，羊栖菜中的微量岩藻甾醇具有保持生物内环境稳定、调节胆固醇、降低血糖含量及抗氧化等多种生理功能［5-7］。羊栖菜中植物甾醇可以作为肝脏X受体(LXR)激动剂，明显降低胆固醇［8］。因此，对岩藻甾醇进行相应的定性及定量分析不可或缺。已知的植物甾醇测定方法有很多，其中传统的测定方法有分光光度法［9］、薄层层析法［9-10］、红外光谱法［10］以及重量法［11］等，上述方法仅适用于测定植物甾醇的总量，很难特异性地针对某一种植物甾醇进行测定。

本工作通过优化流动相流量和检测波长等色谱分离条件，提出了超高效液相色谱法(UHPLC)测定羊栖菜中岩藻甾醇的含量，并进行了有效性验证。

图1 色谱图Fig.1 Chromatograms

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Waters ACQUITYTMUPLC型超高效液相色谱仪，配自动进样器;Milli-Q型净水系统。

岩藻甾醇标准储备溶液:500 mg·L－1，称取岩藻甾醇标准品(纯度大于93%)10.0 mg，用甲醇20 mL溶解配制。密封储存于4℃冰箱中，使用时稀释至所需质量浓度。

流动相用的甲醇、乙腈均为色谱纯，提取用的甲醇和二氯甲烷为分析纯，试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

YMC-Pack ODS-A色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温为室温;流动相为甲醇-乙腈(30+70)混合液，等度洗脱;流量0.8 mL·min－1;进样量10 μL;检测波长210 nm。

1.3 试验方法

将采购的羊栖菜湿样经水洗、切碎等处理后置于55℃真空烘箱中恒温烘干至恒重，研制成粉末状，用样品袋密封，在避光低温条件下保存备用。

称取羊栖菜干粉试样2.000 0 g于250 mL圆底烧瓶中，按料液比1 g/22 mL加入甲醇-二氯甲烷(1 +1)混合液，于70℃恒温水浴锅中加热回流提取90 min，所得溶液在4℃温度下，以5 000 r·min－1转速离心10 min，取上清液，旋转蒸发浓缩后，用甲醇溶解，经0.22μm有机滤膜过滤后，按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按仪器工作条件分别对岩藻甾醇标准溶液及羊栖菜粗提物进行测定，其色谱图见图1。

由图1可知:岩藻甾醇与其他组分得到了较好的分离，即试验建立的高效液相色谱方法适用于岩藻甾醇的检测。

2.2 岩藻甾醇提取条件的选择

试验考察了乙醇、甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷以及丙酮等5种提取剂的提取效率，并综合溶剂毒性等因素，选择甲醇-二氯甲烷(1+1)混合液作为羊栖菜中岩藻甾醇的提取剂。

试验进一步对提取次数、温度、时间、料液比分别进行单因素试验，研究各因素对岩藻甾醇提取率的影响。在确定提取次数为2次的前提下，以料液比、提取时间、提取温度作为试验因素设计了3因素3水平的响应面优化试验，通过回归方程及Design-Expert软件分析得到岩藻甾醇回流提取的最优工艺条件为:料液比1 g/21.89 mL，提取时间89.58 min，提取温度69.28℃。考虑到可操作性，试验将料液比调整为1 g/22 mL，提取时间90 min，提取温度为70℃，并在此提取条件下进行3次平行提取试验，其偏差为2.1%，从而验证该响应面模型及其所得结果准确可靠。

2.3 仪器工作条件的选择

2.3.1 流动相及洗脱方式

流动相的选择将直接影响到目标化合物的峰形及分离效果，是液相色谱分离技术中最重要的参数之一。羊栖菜中岩藻甾醇的含量相对较低，而且所含杂质种类繁杂，同时岩藻甾醇自身有多种同分异构体存在，这些因素都对色谱分离造成了一定困难。此外，为了减少试剂对仪器的损坏，应避免使用二氯甲烷、异丙醇等试剂，而改用甲醇、乙腈及水等试剂。优化后发现，有水相参与或梯度洗脱时岩藻甾醇分离效果不太理想，而单一的有机溶剂经等度洗脱所产生的分离效果较好。试验选择以甲醇-乙腈(3+ 7)混合液作为流动相并等度洗脱进行羊栖菜中岩藻甾醇的测定。

2.3.2 检测波长

由试验可知:在210～400 nm的二极管阵列检测器检测波长内，岩藻甾醇在波长210 nm处有最大吸收［12］，试验选择检测波长为210 nm。

2.4 标准曲线和检出限

按仪器工作条件对0.5，1，10，50，100，200，400 mg·L－1的岩藻甾醇标准溶液进行测定，以岩藻甾醇的质量浓度为横坐标，以其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明:岩藻甾醇的质量浓度在0.5～400 mg·L－1内与峰面积呈线性关系，线性回归方程为y=1.161×104x+7.621×103，相关系数为0.999 8。

以3倍的信噪比所对应的质量浓度计算方法的检出限(3S/N)为0.16 mg·L－1，以10倍的信噪比所对应的质量浓度计算方法的测定下限(10S/N)为0.53 mg·L－1。

2.5 回收试验

向羊栖菜粗提物中添加25，50，100 mg·L－1的岩藻甾醇标准溶液，按仪器工作条件进行测定，结果见表1。

表1 回收试验结果(n=6)Tab.1 Results of test for recovery(n=6)

由表1可知:样品的回收率在91.2%～96.8%之间，相对标准偏差(RSD)在3.2%～6.3%之间。

2.6 精密度试验

在1 d内对样品及各加标溶液分别按试验方法连续测定6次，计算RSD可得日内精密度;对样品及各加标溶液分别按试验方法连续测定6 d，计算RSD即得出日间精密度，试验结果见表2。

表2 精密度试验结果(n=6)Tab.2 Results of test for precision(n=6)

由表2可知:样品及不同加标溶液的日内及日间精密度范围分别为1.1%～5.4%，2.8%～7.0%。说明方法用于检测羊栖菜中岩藻甾醇的含量时，其日内及日间精密度均良好。

2.7 样品分析

按试验方法对羊栖菜样品进行分析，测得岩藻甾醇的质量分数为610μg·g－1。

本工作建立了超高效液相色谱法测定羊栖菜中岩藻甾醇含量的分析方法，并验证了方法的有效性。研究表明，羊栖菜中岩藻甾醇含量较低，但岩藻甾醇的分离效果良好，且方法回收率高，重复性好，具有较高的准确度和灵敏度，适用于羊栖菜中岩藻甾醇的检测。另外，该方法很好地弥补了重量法等传统方法只能对总甾醇含量进行测定的不足，能有效地检测单一植物甾醇的含量。

［1］中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京:中国医药科技出版社，2010.

［2］许忠能，王朝晖，孙立.羊栖菜药用价值的研究进展［J］.中草药，2000，31(11):876-878.

［3］洪咏平，戴志远.羊栖菜食品的开发和利用［J］.中国水产，2002(2):75-76.

［4］张锐，龚兴国，郭建军，等.羊栖菜中岩藻甾醇、马尾藻甾醇以及水溶性多糖的综合提取工艺［J］.农业工程学报，2006，22(4):190-193.

［5］LEE S，LEE Y S，JUNG S H，et al.Anti-oxidant activities of fucosterol from the marine algae Pelvetia siliquosa［J］.Arch Pharm Res，2003，26(9):719-722.

［6］LEE Y S，SHIN K H，KIM B K，et al.Anti-diabetic activities of fucosterol from Pelvetia siliquosa［J］.Arch Pharm Res，2004，27(11):1120-1122.

［7］HOANG M H，JIA Y Y，JI H J，et al.Fucosterol is a selective liver X receptor modulator that regulates the expression of key genes in cholesterol homeostasis in marcrophages，hepatocytes，and intestinal cells［J］.J Agr Food Chem，2012，60:11567-11575.

［8］CHEN Z，LIU J，FU Z F.24(S)-saringosterol from edible marine seaweed Sargassum fusiforme is a novel selective LXRβagonist［J］.J Agr Food Chem，2014，62，6130?6137.

［9］刘海霞，仇农学，赵雁武.苹果籽油中植物甾醇含量的薄层色谱-分光光度法测定［J］.中国油脂，2008，33 (11):76-78.

［10］吴时敏，裘爱泳.植物甾醇及其制品分析［J］.粮食与油脂，1999，25(3):41-44.

［11］顾欣.植物甾醇的气相色谱分析［J］.宁波化工，2001 (2):30-32.

［12］RAJENDRAN I，KAJAL C，VIJAYAN K K，et al.Bioactive sterols from the brown alga Anthophycus longifolius(Turner)Kutzing，1849(=Sargassum longifolium)［J］.Indian J Fish，2013，60(1):83-86.

UHPLC Determination of Fucosterol in Sargassum Fusiforme

LIU Chunping，WANG Wei，CHENG Zhuo，ZHAO Lin，HUANG Xue，LU Yanbin*
(Marine Food Research Institute，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310012，China)

UHPLC was applied to the determination of fucosterol in Sargassum fusiforme.The Sargassum fusiforme sample(2.000 0 g)was extracted with mixed solution of methanol and dichloromethane(1+1).In the HPLC separation YMC-Pack ODS-A chromatographic column was used as stationary phase，and a mixture of methanol and acetonitrile(3+ 7)was used as mobile phase.UV-detection at 210 nm was adopted in the determination.Linear relationship between values of peak area and mass concentration of fucosterol was kept in the range of 0.5－400 mg·L－1with detection limit (3S/N)of 0.16 mg·L－1.Tests for recovery were made by standard addition method at the concentration levels of 25，50，100 mg·L－1，giving values of recovery in the range of91.2%－96.8%.Values of intra-day an inter-day RSD's(n =6)found were in the ranges of 1.1%－5.4%，and 2.8%－7.0%respectively.

UHPLC;sargassum fusiforme;fucosterol

O652.63

A

1001-4020(2017)05-0548-04

10.11973/lhjy-hx201705011

2016-05-13

浙江自然科学基金项目(LY15C200004)

刘春平(1991－)，女，浙江温州人，硕士研究生，主要从事海洋食品活性成分研究

*通信联系人。luyanbin@mail.zjgsu.edu.cn