应用PCR方法快速鉴定SPF金定鸭性别

徐丽晶, 孙 畅, 陆涛峰, 陈洪岩, 赵丽丽

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室, 实验动物与比较医学创新团队,哈尔滨 150069; 2. 东北农业大学生命科学学院, 哈尔滨 150030)

应用PCR方法快速鉴定SPF金定鸭性别

徐丽晶1,2, 孙 畅1, 陆涛峰1, 陈洪岩1, 赵丽丽1

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室, 实验动物与比较医学创新团队,哈尔滨 150069; 2. 东北农业大学生命科学学院, 哈尔滨 150030)

目的 利用PCR方法鉴定SPF金定鸭的性别。方法 根据已有报道合成一对禽类性染色体上的染色质解螺旋蛋白DNA结合蛋白1(CHD1)基因的通用引物gCHD。采集培育中的85只SPF金定鸭血液样品, 提取血液基因组DNA, 进行PCR扩增。通过分析PCR扩增产物凝胶电泳后的条带数判定禽类性别。结果 PCR扩增产物经琼脂糖电泳分析后, 雌性鸭样品扩增出CHD1-Z和CHD1-W, 而雄性鸭样品只出现CHD1-Z 。结论 本文建立的方法可作为禽类性别的有效鉴定方法。

SPF金定鸭; 性别鉴定; PCR

SPF金定鸭饲养繁育过程中，根据不同的生产需求，需要对金定鸭的性别进行鉴定。提前鉴定SPF金定鸭性别，不仅能够为饲养提供合理指导，也能满足科研领域区分禽类性别的需求。目前鉴定禽类性别的分子生物学方法有很多，如外观鉴定方法、鸣管鉴定方法、肛门揉捏鉴定方法和肛门反转鉴定方法等。其中外观及鸣管鉴定法得到的结果准确率较低，在禽类性别鉴定中应用较少。肛门反转鉴定方法常被用于禽类性别鉴定，但由于肛门反转鉴定方法操作规范较复杂，对个体的应激较大且鉴定错误率较高[1,2]。PCR技术因其操作简便、灵敏度高，只需从羽毛、血液和胚胎中提取微量DNA样品即可完成性别鉴定而被广泛应用于遗传育种的实验研究中[3-5]。

家禽的性别由W和Z染色体决定。雌性和雄性基因型分别为ZW和ZZ类型。而传播给子代的Z和W的概率相同，都是50%[2,6,7]。本研究根据刘宏祥等[8]对禽类性染色体上的CHD1基因，设计了一对引物并通过扩增产物凝胶电泳后的条带数目和大小来快速、准确地鉴定禽类的性别。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF金定鸭血液样本由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心[SCXK(黑)2011-007]提供,其中F0代金定鸭27羽, 年龄98周, 体质量3 kg。F1代金定鸭58羽, 年龄45周, 体质量2.0～2.5 kg。每个样品由鸭翅静脉分别取1～2 mL抗凝血，存于-20℃冰箱备用。

1.2 主要试剂

DL2000 DNA Marker购自宝生生物工程(大连)有限公司；血液基因组DNA提取试剂盒购自美国OMEGA公司(D3392-01)，其它常规分子试剂购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 引物设计与合成

参照文献合成禽类的通用引物gCHD[8]，由哈尔滨博仕生物技术有限公司合成，CHD1-Z: 5'-TGCAGAAGCAATATTACAAGT-3', 467 bp CHD1-W: 5'-AATTCATTATCATCTGGTGG-3', 326 bp

1.4 血液基因组的提取

用血液基因组DNA提取试剂盒提取血液DNA样本。

1.5 PCR扩增及检测

PCR 反应体系：共25 mL，2×Premix Taq 12.5 mL，ddH2O 8.5 mL, 上下游引物(10 pmol/L)各1 mL, 提取的DNA 模板 2 mL。PCR反应程序: 95 ℃预变性5 min; 95 ℃变性 30 s, 51 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 30 s，35个循环; 72 ℃延伸 10 min。将扩增产物进行质量分数2 %琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统观察并记录结果。

1.6 性别鉴定

将PCR产物经过质量分数2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，根据条带数目及分子量，判定个体的性别，并与通过翻肛法及常规方法鉴定的性别进行对照，比较两种方法的优劣。

2 结果

2.1 PCR检测

将PCR产物经过质量分数2%琼脂糖凝胶电泳，结果以1-10号鸭为例(图1)。

2.2 性别鉴定结果

通过质量分数2%的琼脂糖凝胶电泳对85只SPF金定鸭进行性别鉴定，以翻肛法及常规方法对相同SPF金定鸭个体进行性别鉴定，将两种方法得到的结果进行对照。结果显示，PCR鉴定与翻肛法及常规方法相比一致(符合率达100%)(表1)。

图1 PCR产物凝胶电泳图

表1 翻肛法及常规方法与PCR鉴定法对金定鸭性别判定结果比较

3 讨论

本实验根据已有文献报道[8]，合成一对禽类的通用引物gCHD，选取F0和F1代共85只SPF金定鸭，运用PCR方法对其进行性别鉴定，并将翻肛法及性状观察法所获得的结果进行比较，结果表明两者符合率100%。说明PCR方法可以用于SPF金定鸭的性别，且灵敏度准确率均较高。王利红等[9]根据已报道的位于家禽W染色体上保守的特异性基因片段对番鸭进行了性别鉴定，得到的结果也充分证明了PCR方法准确度高，可以用于番鸭性别鉴定。胡艳等[10]也利用CHD1基因序列的DNA扩增片段长度多态性特点，成功获得引物，并通过实例验证了PCR方法在家鸭性别鉴定中的有效性和准确性。综合以上的实验结果和文献报道，可以认为PCR方法是一种可靠的鉴定方法，能够用于SPF金定鸭的性别鉴定。

刘铸等[13]和李明等[14]曾利用朱鹮的近缘种东方白鹳W性染色体上的性别相关基因设计引物，用PCR方法成功扩增出朱鹮的性别相关基因, 对朱鹮性别进行了鉴定。同时他们还将其序列与其他5种远源鸟类相应序列进行分析, 证实了PCR方法在鸟类性别鉴定中的科学性和可信性。一些学者[11,15,16],同样应用PCR方法对国家一级保护鸟类进行了性别鉴定，其准确率高达 99%～100%。Grifiths等[17]描述了利用PCR技术鉴定鸡胚性别的方法，证实了PCR方法能够用于鸡胚性别鉴定。这些报道都充分说明了，PCR方法不仅可用于家禽及水禽的性别鉴定，还可用于国家保护鸟类的性别鉴定。

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Application of PCR Method for Rapid Sex Determination in SPF Jinding Duck

XU Li-jing1,2, SUN Chang1, LU Tao-feng1, CHEN Hong-yan1, ZHAO Li-li1
(1. Division of Laboratory Animal and Comparative Medicine, State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology/Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Laboratory Animal and Comparative Medicine, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150069, China;
2. College of Life Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

ObjectiveTo determine the sex of SPF Jinding Duck, the universal primer gCHD of avian chromosomal DNA-binding protein 1 (CHD1) gene on avian chromosomes were synthesized .MethodsBlood of 85 SPF Jinding Duck were collected and genomic DNA was extracted for PCR amplification. The sex of the birds were determined by analyzing the number of bands after gel electrophoresis .ResultsThe CHD1-Z and CHD1-W were found in the PCR products of agarose gel electrophoresis from females and CHD1-Z was from males .ConclusionsThe PCR can be used as an effective method for sex identification in birds.

SPF Jinding ducks; Sex identification; PCR

Q95-33

A

1674-5817(2017)03-0249-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.03.016

2017-04-06

国家科技支撑计划(2015BAI07B02-02); 中国农业科学院基本科研业务费专项(Y2016PT41); 黑龙江省自然科学基金重点项目(ZD2016006)

徐丽晶(1990-), 女, 硕士研究生。研究方向: 动物学。E-mail: 602943167@qq.com

赵丽丽(1983-), 女, 博士, 助理研究员。研究方向:兽医微生物和免疫学。E-mail: zhaolili213@163.com