miR-200b-3p和miR-200b-5p在马立克氏病抗性与易感SPF鸡法氏囊组织的差异表达分析

王瑞琪, 廉传江, 易 诚, 韩凌霞, 杨春文, 陈洪岩

(1. 牡丹江师范学院 生命科学与技术学院, 牡丹江 157011; 2. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室,实验动物与比较医学创新团队, 哈尔滨 150069)

miR-200b-3p和miR-200b-5p在马立克氏病抗性与易感SPF鸡法氏囊组织的差异表达分析

王瑞琪1,2, 廉传江2, 易 诚1,2, 韩凌霞2, 杨春文1, 陈洪岩2

(1. 牡丹江师范学院 生命科学与技术学院, 牡丹江 157011; 2. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室,实验动物与比较医学创新团队, 哈尔滨 150069)

目的 在前期高通量测序分析的基础上，进一步利用荧光定量PCR验证miR-200b-3p和miR-200b-5p 在马立克氏病(MD)抗性(B21单倍型)与易感(B19单倍型)鸡法氏囊组织的差异表达情况。方法 通过经优化后确定的最佳实时荧光定量PCR反应体系和扩增条件, 进行荧光定量PCR分析。结果 miR-200b-3p和miR-200b-5p荧光定量PCR结果与高通量测序结果上下调情况基本一致，但差异表达显著性分析结果却不完全相同。结论 尽管差异表达显著性分析结果不完全一致，但两种方法的结果均提示来源于同一前体的miR-200b-3p和miR-200b-5p可能与MD抗性/易感性相关。

miR-200b; 马立克氏病(MD); 抗性/易感性; 高通量测序; 荧光定量PCR

马立克氏病(Marek’s disease, MD)是由马立克氏病病毒(Marek’s disease virus, MDV)引起的一种高度传染的肿瘤性疾病。随着疫苗的应用, 该病对养禽业的影响逐渐减小, 但全球每年由于MD造成的经济损失依然巨大[1]。近年来，由于MDV毒性不断增强，很可能导致现有疫苗免疫的失败, 如何改进防控策略已显得刻不容缓。因此, 必须了解病毒与宿主之间的相互作用，从宿主角度深入研究MD遗传抗性的机制，在遗传本质上提高家禽的抗病力。

miRNAs是一类内源性的具有调控功能的非编码小RNA, 其通常作用于靶基因mRNA的3’-UTR，抑制靶基因翻译或引起其降解。miRNA在几乎所有生物学过程中发挥重要功能。在多种病毒感染过程中，miRNA通过对宿主或者病毒基因表达进行调控，进而影响病毒在宿主体内的侵染致病过程。目前miRNA已作为一种有效靶标应用于癌症早期治疗和预后治疗[2]。

本团队前期在细胞遗传学和群体遗传学研究的基础上，以SPF鸡为基础培育成功了我国特有的禽类实验动物资源B2、B19(易感)、B21(抗性)等6种MHC-B单倍型鸡群。免疫后MDV超强毒株Md5攻毒结果证实, 不同MHC-B单倍型鸡对MD具有显著的抗性差异。作者进一步选择B21和B19系SPF鸡为研究对象, 在MDV(Md5)攻毒实验的基础上, 利用高通量测序技术分别构建了B21和B19鸡在非感染与感染状态下三个关键阶段(感染后5 d、11 d、20 d)法氏囊组织miRNA差异表达谱，在生物信息学分析的基础上, 筛选并鉴定可能与MD遗传抗性或易感性相关的miRNAs。本文将利用荧光定量PCR方法验证高通量测序结果，并进一步分析miR-200b-3p和miR-200b-5p在B21与B19单倍型鸡感染过程中法氏囊组织的差异表达情况，为进一步探讨它们可能与MD抗性/易感性相关的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与毒株

B21和B19单倍型SPF鸡保存于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽类实验动物种子中心[SCXK(黑)2011-007]，马立克氏病毒Md5株由本实验室保存。

1.2 主要仪器和试剂

Bio-Rad荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司), Sigma 3-18K型离心机(德国Sigma公司), 宝生物工程(大连TaKaRa公司)有限公司的反转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser)和SYBR染料法荧光定量试剂盒(SYBR Premix Ex TaqTM)。

1.3 抗性鸡和易感鸡Md5体内感染实验

取1日龄B21单倍型和B19单倍型鸡各40羽,随机分为正常对照组(命名为B21C、B19C)和感染组(命名为B21I、B19I), 感染组每羽腹腔接种800 pfu MDV超强毒株Md5细胞毒, 正常组和攻毒组分别饲养于负压生物安全二级禽隔离器[SYXK(黑)2011-022], 在接种后的5 d、11 d 和20 d (MDV感染的三个重要时期，分别为前期溶细胞期、潜伏期和后期溶细胞期)分别采集法氏囊组织。

1.4 抗性鸡和易感鸡法氏囊组织miRNA差异表达谱的构建与筛选

分别提取5 d、11 d 和20 d各处理组3羽法氏囊组织总RNA混成池, 与华大基因公司合作完成12个小RNA文库Solexa高通量测序。获得B19和B21攻毒组、各攻毒组与对照组之间miRNA差异表达谱。根据差异表达谱筛选出express reads≥1 000 (高表达)并且差异倍数(fold-change)≥1和fold-change≤-1(差异显著)的miRNA。

1.5 引物设计与合成

利用在线软件自主设计miR-200b-3p和miR-200b-5p特异性反转录引物(RT)、荧光定量引物(正向与反向)和内参U6 snRNA引物，引物由哈尔滨博仕生物公司合成，引物序列如下:

miR-200b-3p RT引物: 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATCATC-3';

miR-200b-5p RT引物: 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCCAAT-3'。

miR-200b-3p正向引物: 5'-GCGGGCTAATACTGCCTGG-3';

miR-200b-5p正向引物: 5'-GCGGGCTCTTACTGGGCAGC-3';

通用反向引物: 5'-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3'。

内参为U6, 正向引物: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3';

反向引物: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.6 荧光定量PCR检测体系建立

利用Trizol法分别提取5 d、11 d 和20 d各处理组法式囊组织总RNA，按试剂盒说明书进行反转录。以反转录好的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，采用经过优化后确定的最佳实时荧光定量PCR反应体系和扩增条件[3]。反应体系：正、反向引物各0.5 mL，cDNA模板1 mL，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ10 mL，DEPC H2O补至20 mL。扩增条件: 95 ℃ 3 min, 1个循环; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 20 s, 40个循环; 75 ℃ 30 s, 41个循环。同时以DEPC H2O代替cDNA为模板作为阴性对照。

1.7 统计学方法

荧光定量PCR差异倍数以-ΔΔCt法计算[4]。所得数据应用SPSS19统计软件进行单因素方差分析, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗性鸡和易感鸡法氏囊组织miRNA差异表达谱的筛选

miR-200b-3p和miR-200b-5p在B21和B19单倍型鸡的5 d、11 d、20 d的正常组间均无显著差异，在感染后的5 d和11 d也均不存在显著差异。但在20 d，miR-200b-3p和miR-200b-5p在B19单倍型鸡感染后均显著上调，而B21单倍型鸡感染后虽上调表达但差异未达到显著水平(表1)。

2.2 荧光定量验证高通量测序

miR-200b-3p荧光定量PCR结果显示，仅B19感染后11 d和B21感染后5 d差异不显著(P>0.05),其他各组间均差异显著(表2)。miR-200b-5p荧光定量PCR结果显示，仅B19感染后11 d差异不显著(P>0.05)，其他各组间均差异显著(表2)。

表1 高通量测序miR-200b-3p和miR-200b-5p在MD抗性与易感鸡法氏囊组织的差异表达倍数Table 1 The fold-change of miR-200b-3p and miR-200b-5p in bursa with Marek’s disease resistance/susceptibility by Solexa sequencing

表1和表2结果比较表明，高通量测序结果中B19和B21感染后miR-200b-3p和miR-200b-5p表达下调的有: B19和B21感染后5 d、11 d二者对照组间; B19感染后5 d感染组对照组间。其余表达均上调, 其中B19感染后20 d感染组对照组间差异显著上调。荧光定量PCR结果中B19和B21感染后miR-200b-3p和miR-200b-5p表达下调的有: B19和B21感染后5 d、11 d二者对照组间; B19感染后5 d感染组对照组间, 其中B19感染后11 d感染组对照组间miR-200b-5p下调，这是表1和表2 miRNA差异表达上、下调关系唯一不同。其余表达均上调。

3 讨论

miRNA-200家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429共5个成员。多数文献支持miRNA-200水平的改变与肿瘤的恶化和细胞的存活相关[5]。miR-200b-3p和miR-200b-5p具有同一个前体(发卡结构)。最近越来越多的文献表明:位于同一发卡结构上的5p端和3p端可作用于相同或不同的靶基因, 发挥相同或不同的功能[5]。miR-200b-3p是从前体3’端加工而来, miR-200b-5p则是从前体5’端加工而来。从以上结果中可以看出, miR-200b-3p和miR-200b-5p两者在相同组织中具有极为相似的表达趋势。这可能与二者同源有关。

表2 荧光定量PCR检测miR-200b-3p和miR-200b-5p在MD抗性与易感鸡法氏囊组织的差异表达倍数Table 2 The fold-change of miR-200b-3p and miR-200b-5p in bursa with Marek’s disease resistance/susceptibility by qPCR

MDV 通过呼吸系统进入宿主体内，被下呼吸道的巨噬细胞吞噬后，运输到胸腺、法氏囊和脾脏等二级淋巴器官。在B 淋巴细胞感染后5～7 d 开始溶解，激活的T 淋巴细胞在此期受到感染，称为早期溶细胞感染阶段。在感染后7～10 d，MDV潜伏在细胞里，遗传抗性较强的鸡可能会长期停留在潜伏感染阶段，在经历一个短暂的晚期溶细胞感染后(18～21 d)，形成肿瘤，而敏感鸡体内病毒不断增殖，未出现肿瘤即早期死亡[6,7]。从表中可以得出，B19品系感染组感染后20 d也就是晚期溶细胞期出现差异极显著性上调，这可能与在晚期形成肿瘤有关, 导致感染组miR-200b-3p和miR-200b-5p两者表达量急剧升高。

B21和B19具有相同的遗传背景，但具有独特的MHC-B单倍型[8-10]，所选的B21为抗性鸡，B19品系为易感鸡。从所得结果可知，在感染后期，B19品系miRNA表达高于B21品系，说明MDV侵染效果在B19品系鸡上更强。这可能与B21品系本身为抗性鸡系有关。

新一代高通量测序技术的发展日新月异[11]。该技术可以对数百万个DNA分子进行同时测序。这使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能[12]。目前国内外已有多个研究小组将高通量测序技术应用到了鸡MD致病过程研究中。通过对鸡胚成纤维细胞(CEF)、肿瘤(细胞、组织)及其他免疫器官(组织)等进行miRNA 差异表达谱构建，从而筛选出一些与MDV侵染宿主过程中相关的miRNA[13]。

实时荧光定量PCR技术同样在现阶段应用广泛, 在基因表达水平分析、突变和多态性研究、病原体的定性和定量检测等方面被科研人员认同。以操作简单、高灵敏度、高特异性、速度快著称[14]。通过该技术同样可以对MDV宿主进行相关miRNA差异表达分析。从miRNA高通量测序结果来看，miR-200b-3p和miR-200b-5p仅在B19单倍型鸡感染后显著上调，其他各时间点组别均无差异表达。而在荧光定量PCR结果中，多数表现为存在显著差异。由此可见应用两种检测方法所得出的结果存在一定差异，而从miRNA上下调情况来看，两种检测方法又存在一致性。反映出这种差异表现在所得结果的差异显著性分析上。造成这种现象最可能的原因是由于两种检测方法检测方式的异同。荧光定量结果是经过多次重复实验所得，表2能通过荧光定量结果真实得出同源的两种miRNA在相同组织中感染后表达具有一致性，这也能反向证明荧光定量PCR结果的可靠性。

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Differential Expression Analysis of miR-200b-3p and miR-200b-5p in Marek’s Disease Resistant and Susceptible SPF Chickens

WANG Rui-qi1,2, LIAN Chuan-jiang2, YI Cheng1,2, HAN Ling-xia2, YANG Chun-wen1, CHEN Hong-yan2
(1. College of Life Science and Technology, Mudanjiang Normal University, Mudanjiang 157011
2. Division of Laboratory Animal and Comparative Medicine, State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology/Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Laboratory Animal and Comparative Medicine, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150069, China)

ObjectiveTo validate high throughput sequencing results by fluorescence quantitative PCR technique and analyze the expression of miR-200b-3p and miR-200b-5p in bursa, and explore possible molecular mechanism associated with Marek’s disease (MD) resistance/susceptibility .MethodsThrough optimization, the ideal amplification conditions and reaction system of real-time fluorescence quantitative PCR were identified .ResultsmiR-200b-3p and miR-200b-5p fluorescence quantitative PCR results and high throughput sequencing results were consistent in down-regulation, but not significant difference. miR-200b-3p and miR-200b-5p two homologous miRNA showed similar expression after infected by Marek’s disease virus (MDV) .ConclusionAlthough the difference is not consistent with the results of significant analysis, miR-200b-3p and miR-200b-5p may be associated with resistance / susceptibility of MD.

MiR-200b; Marek’s disease (MD); Resistance/susceptibility; High throughput sequencing; Fluorescence quantitative PCR

Q95-33

A

1674-5817(2017)03-0244-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.03.015

2016-11-23

国家自然科学基金项目(31500997); 黑龙江省科技计划项目(PC13S04)

王瑞琪(1991-), 男, 硕士研究生, 专业: 动物学。E-mail: 870831997@qq.com

杨春文(1959-), 男, 博士, 专业: 动物学。E-mail: yangchunwen@sina.com

陈洪岩(1963-), 男, 博士, 专业: 预防兽医学。E-mail: chenhongyan@caas.cn

廉传江(1981-), 男, 博士, 专业: 实验动物学。E-mail: lcj121916@163.com