仙台病毒核酸测序检测方法的建立

张欢欢, 余陈欢, 戴方伟, 马 月, 郎秋蕾, 王 瑜, 应华忠

(1. 浙江省医学科学院浙江省实验动物中心, 杭州 310013;

2. 杭州联川生物技术有限公司, 杭州 310018)

仙台病毒核酸测序检测方法的建立

张欢欢1, 余陈欢1, 戴方伟1, 马 月1, 郎秋蕾2, 王 瑜2, 应华忠1

(1. 浙江省医学科学院浙江省实验动物中心, 杭州 310013;

2. 杭州联川生物技术有限公司, 杭州 310018)

目的 建立仙台病毒(SeV)的核酸测序检测方法。方法 根据SeV序列设计覆盖不同毒株的通用引物，然后优化成测序引物并摸索建库条件，进行核酸测序和结果分析。结果 获得1对特异性强的通用引物，序列为: 上游引物5'-GCTGCAAAACGCTGTGGG-3'，下游引物5'-TGGRACYTCAGAAAGAATRGG-3'; 建库条件优化为：第一轮以cDNA为模板用通用引物扩增，第二轮以第一轮产物为模板用测序引物扩增。测序分析可以有效地将SeV与其他微生物区分开，并且精确到TianJin 亚株。结论 建立了SeV核酸测序检测方法，为后续SeV感染实验动物的检验检疫提供依据。

仙台病毒(SeV); 核酸测序; 检测

仙台病毒(Sendai virus, SeV), 亦称副流感病毒1型或血凝病毒(HVJ), 是副粘病毒科的一种单股负链RNA病毒[1]。SeV传染性强、易扩散, 是严重危害实验动物的传染病之一, 同时也是人类呼吸道感染的重要病源。由于其与人类副流感病毒血细胞吸附第2型(HA-2)病毒同属副流感病毒I型, 二者间有十分密切的抗原关系[2], 常散发或混合在流感流行中, 可引起婴幼儿下呼吸道严重疾病。啮齿类动物感染SeV会对其淋巴细胞转化、致瘤作用及繁殖等产生影响, 从而影响实验结果; 此外, 动物一旦感染很难清除,严重影响幼鼠生长发育并降低成年鼠的繁殖率[3]。

实验动物病原微生物检测的国家标准中, 无论是清洁级还是SPF级, SeV都是必检项目。目前最主要的检测方法是血清学试验，但该方法的检测结果受机体抗体水平影响, 不利于早期疫情控制[4,5]。近年来分子生物学技术广泛应用于微生物检测，包括实时定量PCR[6]、多重PCR技术[7]; 其他还有基因芯片[8]和环介导等温扩增技术(LAMP)等[9]，这些方法都能够快速、准确的进行检测，但不能有效区分仙台病毒亚型，对突变型也不能准确判断。

核酸测序技术在微生物检测[10]方面具有几个明显优点——通量高、周期短、准确率高、操作简单、成本低。而其最大的优势是一个测序通道内可放置几十甚至上百个样品，不仅降低了单个样本的检测成本，更实现了多种微生物同时检测[11]，极大地缩短了实验动物微生物检测周期。本研究以此技术为基础，建立了一种能够快速检测SeV亚型的检测方法。

1 材料与方法

1.1 病毒样品及处理

SeV(TianJin株)，由上海实验动物中心馈赠; SeV(Fushimi株和52株)，由浙江省疾病预防控制中心提供；其余病毒株和沙门氏菌(Salmonella entericaserovar Typhimurium)均为本实验室保存。样品采用病毒RNA提取试剂盒提取并反转录成cDNA进行后续实验。

1.2 主要试剂

Viral RNA Kit(美国Omega Bio-Tek公司，R6874)，PrimeScriptÒRT reagent Kit[宝生物工程(大连)有限公司, DRR037A], Premix Ex TaqTM Hot Start Version[宝生物工程(大连)有限公司, RR030A], DL2000 DNA Marker [宝生物工程(大连)有限公司, 3427], Axygen PCR Clean Up Kit (美国康宁, AP-PCR-500), QubitdsDNA HS Assay Kit(美国Invitrogen公司，Q32851)，MiSeq V2 Reagent Kit (美国Illumina公司，MS-102-2002)。

1.3 通用引物选择及测试

设计扩增区分不同亚株的SeV通用引物，设计原则是通用引物位于基因组保守区，其间序列变化差异较大。然后以SeV以及阴性样品cDNA样本为模板进行扩增，测试引物的特异性。

1.4 测序引物优化

在通用引物(正向引物为FP，反向引物为RP)的基础上，加上接头序列(Linker)、区分样本的条形码序列(Index)以及增加终文库均一性和丰富度的连接碱基(Heterogeneity Spacer)，如图1所示。该引物可以直接用于建库。

图1 建库引物设计示例

1.5 建库条件摸索

SeV建库主要从退火温度进行条件摸索，反转录体系RNA模板量为500 ng，建库PCR体系均为25 mL。采用两步PCR法: 第一步是用通用引物进行PCR扩增, 循环数为40个, 退火温度为56℃; 第二步是以第一步的PCR产物作为模板, 用建库引物进行PCR扩增, 循环数为10个, 退火温度为58℃。

1.6 核酸测序体系的特异性和敏感性检测

将各检测样本分别核酸提取、建库。采用Illumina Miseq测序仪进行核酸测序，具体方法如下: Miseq 测序得到的 PE reads 首先根据overla 关系进行拼接，将成对的 reads 拼接成一条序列，同时对reads 质量和 merge 的效果进行质量质控和过滤，去除序列末端的后引物和接头序列、多碱基N、polyA /T 尾巴及低质量碱基; 去除所得序列的barcode 标签序列、前引物序列；丢弃长度短于200 bp、模糊碱基数>0、序列平均质量低于20的序列。核酸测序结果与样本信息进行对比，评价核酸测序体系检测仙台病毒特异性和敏感性。

1.7 检测结果的重复性、特异性及灵敏性分析

为进一步确认其灵敏性和最低检测限, 提取病毒滴度为100TCID50的SeV细胞培养物中总RNA，测定其浓度为78 ng/mL，进行10倍比稀释，设置100～10-6的7个稀释浓度样品，用所建立的方法进行检测。并采用文献[12]RT-PCR的方法进行平行检测，确定该法的SeV最低检出量。同时，分别提取实验小鼠常见病原微生物(沙门氏菌、鼠痘病毒、小鼠肝炎病毒和小鼠肺炎病毒)的总RNA，采用核酸测序方法检测，确定该法的特异性。

2 结果

2.1 通用引物设计及测试

SeV总基因组序列为15 384 bp，通用引物要尽可能多的覆盖各种SeV毒株的序列，经过比对，本研究选取的引物序列如表1，其中反向引物包含3个兼并碱基，可以扩增多种SeV。

表1 SeV通用引物基本信息

以SeV cDNA和阴性对照为模板, 测试通用引物的扩增效率以及特异性，结果如图2所示, 仅在SeV样本扩增到单一条带, 而在SeV阴性样品(小鼠肺炎病毒和小鼠肝炎病毒的混合品)中, 无法扩增得到条带, 证明该通用引物具有非常强的特异性。

2.2 建库引物设计

本研究SeV建库引物序列如表2所示。其中，正向引物(YSV-F23)和反向引物(YSV-R19)的条形码序列(Barcode)不同，而且每个样品在建库时都有自己独特的一对barcode序列，通过相应的Barcode可以将样品从总文库中区分。

图2 SeV通用引物测试

2.3 建库条件摸索

反转录后，首先尝试建库引物直接扩增，未获得理想PCR产物。然后优化为两步PCR法，以此条件进行建库，扩增到单一条带，证明该建库条件可行，结果如图3。

2.4 测序结果分析

通过barcode的区分, 调出SeV序列, 拼接后共得到91个有效序列, 结果显示为SeV_Tianjin亚株, 无其他SeV亚株, 也无其他病毒序列。表3中列出了排位前10的数据结果。由于前期采用双盲实验, 测序结果与样品制备方比对后完全一致, 证明该法具有较高的准确性，且可以精准到病毒株亚型的确认。

表2 建库引物序列信息

图3 SeV建库PCR的电泳结果

2.5 检测结果的重复性、特异性及灵敏性分析

各样本检测到的SeV与目的病毒株基本一致，且多次重复，检测结果均一致(表4)。本研究建立的方法可鉴定出不同来源的SeV病毒株亚型; 且SeV病毒液经105稀释(即7.8×10-4ng/mL)后，仍能被分析、检出。采用RT-PCR方法进行平行检测，该法的SeV最低检出量仅为0.78 ng/mL(即原液102稀释)，远远大于核酸测序方法的SeV最低检出量，表明核酸测序方法的敏感性明显高于RT-PCR法。此外，其余病毒株和沙门氏菌作为干扰样品，以及平行空白试剂作为阴性对照，均不能被检测，证明该法具有较好的特异性。

表3 SeV部分序列结果

3 讨论

病原微生物的快速检测一直是实验动物质量控制的重点和难点。随着近年来各类动物资源的大量开发应用，环境变化以及药物滥用，一些在动物体内潜藏的病原体发生变异，开始产生人兽感染；而有些已知病原体，发生变异或获得了新的特性，适应于人体，增加了致病性[13]。尽管目前PCR 技术的普遍应用，已可满足临床各种感染性疾病的快速检测，但是特异性探针设计困难，难以做到逐一检测，且只能检测已知病原体。特别是很多新发病原微生物基因组序列信息缺乏或不足，无法检测新的突变亚型和未知病原体[14,15]，因此无法满足当今快速应对生物安全防御的要求。

表4 SeV样本核酸测序检测结果

本研究建立了一种SeV核酸测序检测方法。首先，在设计通用引物时，既要求引物位置具有保守性，又要求扩增产物具有区分不同毒株的特异性，综合以上原则，作者在反向引物内设立了3个兼并碱基，可以与多种模板进行结合，扩增结果也显示在阴性样品中无法扩增，具有SeV特异性。其次，建库条件摸索是一个非常复杂的体系。因为建库PCR采用的是90～97 bp长度的长链引物，这与普通16～25 bp的引物PCR扩增条件会有很多不同，长链引物扩增条件比普通引物扩增的条件要苛刻得多。作者在尝试用建库引物直接扩增的方法未获得理想PCR产物后，之后优化为两步法，并进行退火温度的条件摸索, 最终确定了建库条件。这为其他微生物检测的建库条件提供了很好的借鉴。

本研究所有SeV样品、其他病毒株样本以及42个沙门氏菌样品均通过双盲实验一起上机测序。测序数据分析结果表明, 核酸测序不仅能够快速检测SeV, 还能区分到SeV病毒亚株。这一结果也与前期沙门氏菌测序准确率相一致[16], 表明采用核酸测序法可快速、微量、准确地区分不同微生物样品, 为实验动物多种病原微生物的同时检测提供了参考。

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Development of Detection Method for Sendai Virus by Nucleic Acid Sequencing

ZHANG Huan-huan1, YU Chen-huan1, DAI Fang-wei1, MA Yue1, LANG Ju-lia2, WANG Yu2, YING Hua-zhong1
(1. Zhejiang Laboratory Animal Centre, Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013, China;
2. LC-bio technology company, Hangzhou 310018, China)

ObjectiveTo develop the method for detection of Sendai virus by nucleic acid sequencing .MethodsGeneral primers according to Sendai virus genome sequences were designed and optimized to sequencing primers. Then the best condition of creating library was established. This method was verified by nucleic acid sequencing and analysis .ResultsA pair of highly specific general primers was designed. The sequences are respectively 5'-GCTGCAAAACGCTGTGGG-3' and 5'-TGGRACYTCAGAAAGAATRGG-3', and the sequencing primers were established by ligated adaptor sequences to the 5'-end of general primers. The established condition of creating library and library products were obtained by the first round amplification using general primers and the second round using sequencing primers. Sendai virus was effectively distinguish from other organisms by nucleic acid sequencing and analysis, and was precised to TianJin strain .ConclusionA detection method was developed for Sendai virus by nucleic acid sequencing, which may be as the base for microbiological detection in laboratory animals.

Sendai virus; Nucleic acid sequencing; Detection

Q95-33

A

1674-5817(2017)03-0204-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.03.006

2016-11-14

浙江省卫生高层次人才, 浙江省科技厅院所专项(2012F30026, 2016F30001), 浙江省科技厅实验动物计划项目(2016C37106)

张欢欢(1985-), 女, 助理研究员, 研究方向: 动物疾病模型。E-mail: zhanghuanhuan2014@126.com

应华忠(1968-), 男, 研究员, 研究方向: 动物疾病模型。E-mail: yhz0101@126.com