蚕丝固定血红蛋白光谱法测定氧含量

王景宇，周 玲，姜 超，郭 明

（大连大学 环境与化学工程学院，辽宁 大连 116622）

蚕丝固定血红蛋白光谱法测定氧含量

王景宇，周 玲，姜 超，郭 明*

（大连大学 环境与化学工程学院，辽宁 大连 116622）

将血红蛋白固定在蚕丝蛋白膜上，制成了一种新型的氧气传感器，采用反射光谱检测此传感器对氧气的响应。结果表明在氧含量为10%～50%的范围内，其光谱图最高反射率与氧含量成线性响应。可用于检测空气中的氧含量，正常室温条件下，传感器膜可以连续使用半年以上。

蚕丝蛋白；血红蛋白；氧含量

1 绪论

血红蛋白(Hemoglobin-Hb)存在于血液的红细胞中。血红素是血红蛋白的主要成分，是原卟啉IX与铁的配合物[1]。图1为血红素分子结构，其生理功能是在体内运输氧。

图1 亚铁血红素分子

蚕丝蛋白是从蚕丝纤维中提取的蛋白，具有无毒性、无刺激性、且具有良好的透气透湿性和优异的生物相容性和生物可降解性[2,3]。在生物技术领域，丝素膜可作为固定化酶的载体和制备生物传感器[4]。

有各种检测空气中氧气的方法如气相色谱法[5]、化学燃烧法[6]等，但这些方法有一定限制，如气相色谱法需要大型的仪器，而化学燃烧法误差较大。

本文将蚕丝蛋白制成带有血红蛋白的薄膜，利用血红蛋白携带氧气的特性，对空气中的氧气含量进行测定。

2 实验方法

2.1 仪器与药品

仪器：超声波清洗仪（KQ-100，昆山市超声仪器有限公司）、USB4000微型光纤光谱仪（美国海洋光学）、日立U-3900/3900H型紫外分光光度计（上海百贺仪器科技有限公司）、电热套（DKT-B型，郑州长城科工贸有限公司）。

药品：家蚕蚕茧、牛血液Hemoglobin (Solarbio)、27MM透析袋（BIOSHARP）、无水氯化钙（粒）、无水碳酸钠、无水乙醇购自天津市科密欧化学试剂有限公司，均为分析纯。

2.2 蚕丝蛋白的提取

按照陶俊逸[7]等人提取蚕丝蛋白的方法，对蚕茧层进行两次脱胶并且盐解，得到浓度约1%左右的蚕丝蛋白溶液。最后对此溶液进行浓缩、提纯，制成7%的蚕丝蛋白水溶液。

2.3 血红蛋白蚕丝膜的制备

将0.1 g的血红蛋白加到5 mL蚕丝蛋白溶液中，滴加到聚碳酸酯薄片上，在烘箱中干燥成膜。

3 结果与讨论

3.1 血红蛋白的紫外光谱图

采用紫外光谱仪检测蚕丝蛋白溶液和含有血红蛋白的蚕丝溶液，结果如图2。从图中可以看出，蚕丝蛋白在波长为275 nm的位置有吸收峰，含血红蛋白的蚕丝蛋白在波长为275 nm和406 nm处均有特征吸收峰，而406 nm处的峰应为血红蛋白的。这与文献的中的血红蛋白的紫外峰是一致的。图2中右下角小图为制得的血红蛋白蚕丝膜。

图2 蚕丝蛋白与蚕丝蛋白固定血红蛋白的紫外光谱图

3.2 氧气传感器的性能考察

将制备的血红蛋白蚕丝膜通入不同氧含量的气体，然后测量其反射光谱。实验结果见图3，可见最大反射波在均在483 nm附近。本实验采用的是氧气和氮气的混合物，随氧含量的升高，反射光谱峰高升高，在氧含量为 10%、20%、30%、40%、50%下，其反射峰高分别为 35.7%、44.0%、52.1%和69.1%。血红蛋白蚕丝膜能够对不同氧含量的气体具有响应可能是由于血红蛋白可以结合氧气的原因。主要原因是亚铁血红素分子与氧气的结合引起 Fe（Ⅱ）的微小移动，其接受了O2的一对电子，Fe（Ⅱ）为八面体配位，而且其价电子总数为 18，所以氧合血红素亚铁是比较稳定的构型。氧含量升高使血红蛋白膜结合的氧气增多，使血红蛋白变成 R态，即松弛态，也更稳定，从而引起反射的峰高升高[8]。

前面的实验是测定血红蛋白的吸收峰（Absorption），但传感器膜中的其它物质会影响实验的测定结果。而本实验测定的是反射峰（reflanctance），这样可以去除掉膜本身对光谱的影响，干扰更少。

图3 传感器在不同氧含量下的反射光谱

3.3 标准曲线

将氧含量和最高反射率作图，得到对应的方程为y = 0.82907 x +27.3115，相关系数R2为0.99956。其标准曲线如图4。因此该血红蛋白蚕丝膜可以作为传感器测定不同气体的氧含量。

图4 传感器测定氧的标准曲线

3.4 样品测定

将空气通入氧气传感器中，测定反射率，实验结果见图5，其反射峰高在波长483 nm下，最大反射率为45.5%。根据标准曲线计算得到空气中氧气含量为21.95%，与实际含量数值相接近。

3.5 膜寿命测定

将制备好的血红蛋白蚕丝蛋白膜放入自封袋，保存6个月仍可对氧含量进行检测，且性能良好。这说明此血红蛋白蚕丝膜不但检测方便，利于保存，而且使用寿命较长，携带方便。

图5 置于空气中的光谱图

4 结论

本实验选用丝素蛋白固定血红蛋白制作氧传感器，对空气中氧含量进行测定，方法简便、测定准确，而且所用材料皆为生物材料，绿色环保，其应用价值较大，前景较好。

[1] Alayash A I. Oxygen therapeutics: can we tame haemoglobin[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2004, 3(2): 152-159.

[2] WANG S, ZHANG Y, YIN G, et al. Electrospun polylactide silk fibroin-gelatin composite tubular scaffolds for small diameter tissue engineering blood vessels[J]. Journal of Applied Polymer Science, 2009, 113(4): 2675-2682.

[3] WANG S D, ZHANG Y Z, YIN G B, et al. Fabrication of a composite vascular scaffold using electro spinning technology [J]. Materials Science and Engineering: C, 2010,30(5): 670-676.

[4] 李志林, 吴瑞红. 蚕丝蛋白开发利用的研究进展[J]. 广东化工, 2006, 33(2): 16-19.

[5] 陶俊逸, 邵骏骅, 张海萍, 等. 蚕丝蛋白制备方法的研究[J]. 蚕桑通报, 2012, 43(3): 18-21.

[6] 贾海琪, 何俊友. 测定空气里氧气含量改进探析[J]. 中国教育技术装备, 2008(2): 45-45.

[7] 吴振伟. 气相色谱法测定氧气的含量[J]. 大氮肥, 2008(3):198-200.

[8] 陈耀强, 王婧, 万家义, 等. 血红蛋白的分子结构及与其载氧功能相关的药物研究进展[J]. 绵阳师范学院学报,2004, 23(5): 1-4.

Spectrometry Determination of Oxygen Content by Silk Fibroin Fixed Hemoglobin

WANG Jing-yu, ZHOU Ling, JIANG Chao, GUO Ming*
(College of Environment and Chemical Engineering, Dalian University, Dalian 116622, China)

A new kind of oxygen sensor was fabricated by hemoglobin fixed with silk fibroin. This sensor was used to determine the oxygen in air with reflectance spectrometry. Experimental results showed that along with the increase of content of oxygen at 10%～50%, the maximum of reflect peak was increase too in the linear relation. This sensor could be used to determine the content of oxygen in air. In the normal condition, the sensor membrane could be continuously used for half a year.

silk fibroin; hemoglobin; oxygen content

TQ460

A

1008-2395(2017)03-0036-03

2016-12-28

王景宇（1991-），女，硕士研究生，研究方向：一维光子晶体传感器的制备及其性能。

郭明（1965-），男，教授，博士，硕士生导师，研究方向：光子晶体。