综合干预对D-半乳糖衰老大鼠骨骼肌自由基和激素代谢影响的研究

刘丰彬

（大连大学 体育学院，辽宁 大连 116622）

综合干预对D-半乳糖衰老大鼠骨骼肌自由基和激素代谢影响的研究

刘丰彬

（大连大学 体育学院，辽宁 大连 116622）

讨论负重跑的运动训练和补充大豆多肽的营养干预对D-半乳糖衰老大鼠的骨骼肌组织激素代谢和自由基代谢的影响。56只健康雄性SD大鼠随机分为7组：对照组，模型组，小负重跑组，大负重跑组，补肽组，补肽小负重跑组，补肽大负重跑组。造模过程中每天观察各组大鼠外观体征的变化。6周后处死大鼠，测试血清以及骨骼肌组织各项指标。所有造模组大鼠均出现不同程度的衰老外观体征，负重跑训练和补肽可以在一定程度上缓解这种现象；与对照组实验结果相比，模型组大鼠的骨骼肌MDA含量、SOD活性、脂褐素含量都明显地升高，SOD/MDA有降低的趋势，但没有显著性差异，负重跑训练或补肽除了可以进一步提高骨骼肌SOD活性外，均可显著性地逆转其他的趋势，并且效果更为显著多为小负重跑组，同时在以上情况下，两种手段均具有显著的交互作用；与成年组相比，模型组大鼠血清的T和GH含量、T/C比值显著性降低，血清C含量显著性升高，血清IGF-I含量有下降的趋势，但无显著性差异，负重跑训练或补肽均可以有效的反转上述的趋势，多数以小负重跑训练组的干预效果更为明显，并且两种干预手段交互作用明显。负重跑的运动训练或补充大豆多肽的营养干预均可以显著改善D-半乳糖衰老大鼠的骨骼肌组织中激素代谢紊乱和自由基代谢紊乱的状况，以小负重跑训练组的效果最好，两种干预手段叠加使用有更显著的效果。

骨骼肌；大豆多肽；负重跑训练；自由基；激素；衰老

0 引言

随着经济的发展和医学科学水平的提高，人口的老龄化已经成为我国一个新的突出的社会问题。截至2015年底，我国60岁及以上老年人口2.22亿人，占总人口16.1%，其中65岁及以上人口1.44亿人，占总人口10.5%。面对这样一个巨大的数字，衰老和抗衰老的研究已经受到社会普遍的关注。众所周知，骨骼肌是人体进行体育运动最重要的器官，而且研究显示，骨骼肌也是人体最早出现衰老的机体组织之一。[1,2]目前，针对骨骼肌衰老领域的研究已经成为国内外体育科研工作者、专家和学者关注的重点内容之一。

本文采用了衰老基础医学研究中常采用的 D-半乳糖经经皮下注射的方法，来建立大鼠骨骼肌衰老的亚急性模型，并在衰老形成的过程中，选择负重跑运动训练干预和补充大豆多肽营养干预两种方法，结合对大鼠的外部表现、自由基代谢和激素代谢等相关指标变化的观察，分析运动和营养对骨骼肌衰老发生过程中出现过早的干预效果，接下来探讨其中可能的机制，为今后研发出更加科学和合理营养补充物，以及提出更有针对性的运动方式来对应对老年人骨骼肌的衰老进程，进行必要的实验尝试，并开辟一条有益的途径和方法。

1 研究方法

1.1 实验分组

Sprague Dawley雄性大鼠56只，体重平均300 g左右，清洁级，3月龄，河北医科大学动物实验中心提供。所有大鼠购回后要适应性饲养一周，并统一编号和称重，随机分 7组：对照组（C）：大鼠常规饲养六周，并且维持日常活动；模型组（M）：大鼠皮下注射 D-半乳糖造模六周，维持日常活动；小负重跑组（S）：造模和生理盐水灌胃六周，进行小负重的跑台运动训练；大负重跑组（B）：造模和生理盐水灌胃六周，进行大负重的跑台运动训练；补肽组（P）：造模和生理盐水灌胃六周，维持日常活动；补肽+小负重跑组（PS）：造模和大豆多肽灌胃六周，进行小负重的跑台运动训练；补肽+大负重跑组（PB）：造模和大豆多肽灌胃六周，进行大负重的跑台运动训练

1.2 实验处理

依据国内成熟的方法进行了 D-半乳糖衰老骨骼肌亚急性模型的复制[3]，其中 D-半乳糖（5%，200 mg/kg/d）进行了大鼠后颈背部的皮下注射，每日 1次，连续六周。

跑台负重跑运动训练方案参考Bedford等[4]和刘丰彬[5]的方法，跑速15 m/min，坡度0°，跑和休息各2 min交替进行为1组，每天6组连续进行，周日休息，共进行六周。根据之前预实验的测试结果，大鼠最大负重的30%和70%作为小负重和大负重的标准。

灌胃的大豆多肽主要包括五肽、六肽和八肽，分子量在200～600 D之间，总蛋白含量超过90%，纯度超过80%。每次负重训练后的30分钟以内，所有补肽组大鼠灌胃大豆多肽溶液（15%，0.15 g/100g），每天1次，连续进行6周，所有负重跑训练组大鼠灌胃等量的生理盐水溶液[6]。

1.3 动物取材

实验进行到6周结束后，所有大鼠断食12小时后开始取材。戊巴比妥钠麻醉（1%，50 mg/kg），取血并分离血清，-30℃保存待测生物化学指标。取少量大鼠腓肠肌组织，按照1：9（W/V）加入4℃生理盐水中，-30℃保存匀浆上清液，待测骨骼肌生化指标。

1.4 测试指标

1.4.1 大鼠外观体征

每日观察各组大鼠体毛、精神状态和活动等一般情况。

1.4.2 大鼠骨骼肌组织的匀浆指标

超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定，采用黄嘌呤氧化酶法；丙二醛（MDA）含量的测定，采用硫代巴比妥酸法；脂褐素（Lipofuscin）含量的测定，采用物理荧光比色法。

1.4.3 大鼠血清指标

睾酮（T）、皮质醇（C）和生长激素（GH）均采取液相平衡竞争的放射免疫分析法（RIA）测试；胰岛素样生长因子-1(IGF-I)采用酶联免疫（ELISA）的方法测试。

1.5 统计分析

数据采用平均值±标准差表示。用SPSS 13软件进行数据分析处理。单一因素如方差齐，采用单因素方差分析，显著性差异用 S-N-K的方法进行比较，如方差不齐，采用秩和检验或自然对数转换。多个研究因素对主效应和交互作用的影响，采用双因素方差分析。P＜0.05和P＜0.01确定差异为显著性和非常显著性水平。

2 结果

2.1 大鼠外观体征观察

实验前所有大鼠反应、毛发、饮食、饮水和活动均正常。在造模过程中，C组大鼠的状态良好，毛色发亮并且有光泽。随着造模时间的增加，除C组外，其他各组大鼠均出现了不同程度的衰老表现，比如反应迟缓，行动缓钝，体毛发黄、干枯和无光泽等。M组大鼠背部和两颊部均出现了不同程度的掉毛现象，尾部部分有色素和斑点的沉着。PS组和S组的大鼠每次干预后能维持正常活动，疲劳感小，还有部分大鼠还能够站立张望。PB组和B组的大鼠在每次干预后均出现懒动、俯卧和疲劳的现象，但第二天再次训练时能恢复正常表现。

2.2 丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性的比较

如表1、2所示：和C组相比较，M组大鼠的骨骼肌组织丙二醛（MDA）的含量显著性上升（P＜0.01），超氧化物歧化酶（SOD）的活性显著性升高（P＜0.05），SOD/MDA比值表现为下降的趋势，但无统计学差异（P＞0.05）。

经过双因素的方差分析，补肽或负重跑训练都可以导致 D-半乳糖衰老大鼠的骨骼肌组织的SOD/MDA比值和SOD的活性显著性升高（P＜0.01和P＜0.05），以P组的表现最为显著，MDA的含量虽然表现出下降的趋势，但无统计学差异（P＞0.05）；负重跑训练叠加补肽使 D-半乳糖衰老大鼠骨骼肌组织的 SOD/MDA比值和 SOD的活性显著性升高（P＜0.01），以PB组的表现最为显著，而MDA的含量显著性降低（P＜0.05），但以PS组的表现最为显著，两者交互作用明显。

表1 大鼠骨骼肌组织MDA含量、SOD活性及SOD/MDA比值的比较（n=8）

表2 大鼠骨骼肌组织MDA含量、SOD活性及SOD/MDA比值双因素的方差分析

2.3 脂褐素含量的比较

如表3、4所示：和C组相比较，M组大鼠的骨骼肌组织脂褐素（Lipofuscin）的含量显著性升高（P＜0.01）。

表3 大鼠骨骼肌组织的脂褐素含量比较（n=8）

表4 大鼠骨骼肌组织的脂褐素含量的双因素方差分析

经过双因素的方差分析，负重跑的运动干预可以使 D-半乳糖衰老大鼠骨骼肌组织 Lipofuscin的含量出现下降的趋势，但无统计学差异（P＞0.05），补肽可以使Lipofuscin的含量出现显著性下降（P＜0.05），以P组的表现最为显著，负重跑训练叠加补肽可以使D-半乳糖衰老大鼠骨骼肌组织的 Lipofuscin含量出现进一步的下降（P＜0.05），以PS组的表现最为显著，两者交互作用显著。

2.4 睾酮和皮质醇含量的比较

如表5、6所示：和C组相比较，M组大鼠的血清中睾酮（T）含量和T/C比值显著性降低（P＜0.01），而皮质醇（C）含量显著性升高（P＜0.01）。

表5 大鼠血清的C含量、T含量及T/C比值的变化（n=8）

表6 大鼠血清的C含量、T含量及T/C比值的双因素方差分析

经过双因素的方差分析，补肽或负重跑训练都可以使D-半乳糖衰老大鼠血清的T含量和T/C比值出现显著性升高（P＜0.01），C含量显著性降低（P＜0.05），以S组的表现最为显著；负重跑训练叠加补肽使D-半乳糖衰老大鼠血清的T含量和T/C比值都可以进一步升高（P＜0.01），C 含量则进一步降低（P＜0.05），以PS组的表现最为显著，两者交互作用明显。

2.5 生长激素含量和胰岛素样生长因子-1含量的比较

如表7、8所示：和C组比较，M组大鼠血清胰岛素样生长因子-1（IGF-I）含量表现出降低的趋势，但无统计学差异（P＞0.05），而M组大鼠血清的生长激素（GH）含量则表现出显著性降低（P＜0.01）。

表7 大鼠血清的IGF-I含量和GH含量的比较（n=8）

表8 大鼠血清的IGF-1含量和GH含量的双因素方差分析

经过双因素的方差分析，补肽或负重跑训练都可以使D-半乳糖衰老大鼠血清的IGF-I含量和GH含量表现出显著性升高（P＜0.01，P＜0.05），以 S组的表现最为显著；负重跑训练叠加补肽能使 D-半乳糖衰老大鼠血清的IGF-I含量和GH含量表现出进一步升高（P＜0.01，P＜0.05），以PS组的表现最为显著，两者交互作用显著。

3 讨论与分析

从我国古代炼丹术和长生不老药到现代医学的抗衰老手段与药物，各国科学家都在不断地探索攻克衰老这个国际性医学难题的方法和手段[7,8]。运动和营养干预在人体退行性变化和与衰老有关疾病的发生、发展中发挥作用也越来越受到重视。如何通过运动和营养这两种相对安全的方法，对人体机能退行性改变重要表现之一骨骼肌的衰老进行相应干预，并探讨其可能的机制，值得深入研究。

目前，体育科学领域普遍认同的观点，老年人的骨骼肌本身具有良好的可训练性，进行科学和合理的力量训练，尤其是适宜的抗阻力训练能够有效改善老年人力量素质，从而提高和改善老年人的健康水平。但目前，多数相关研究只是停留在定性层面，指标也较为单一，缺乏定量指标和作用机理的综合研究[9-11]。因此，本研究借鉴本课题组以往的研究经验[5,13]，采取大鼠负重跑模型模拟人体抗阻力训练，根据相关的训练参数和训练原则，最终确定了本研究的大鼠运动训练方案。

国内外很多研究表明，补充大豆多肽可以显著的提高骨骼肌的力量和质量，并且还具有提高机体运动能力和加速疲劳恢复的效果，但多数的研究对象是运动员，缺少针对普通人群，特别是缺少针对营养状况普遍欠佳的中老人的研究。从不同的角度入手，采用较长的干预时间，选取大豆多肽作为营养补剂，观察其对骨骼肌衰老的作用和影响效果，并探讨其可能的作用机制，国内外目前还没有见到相关研究的报道[14-16]。因此，本研究在参考之前预实验和营养实验一般原则的基础上，确定了本研究的营养干预方案。

衰老是在生物体成年后出现的一系列渐进性、多器官系统、多功能的退行性改变。所以，动物在衰老的过程中也会在外观特征上发生一系列的变化。本研究发现：大鼠在注射D-半乳糖以后，从第3周开始，M 组的大鼠开始出现体毛发黄、脱毛、失去光泽的现象，同时皮毛的弹性也在下降；接下来，大鼠出现行动缓慢、发懒、精神萎靡不振、尾部色素附着等现象，并且随着时间延长而加重，这与以往的研究结果相一致[3,17]。负重跑训练组和补肽组的大鼠，虽然也注射等剂量的D-半乳糖，但是大鼠多数在D-半乳糖造模第4周或第5周后才开始出现轻微的脱毛现象，并且多数大鼠精神状态不错，脱毛程度不明显，与之前相比日常行为的改变也不十分明显。由此得知：两种干预方式可以有效改善 D-半乳糖衰老大鼠因衰老而导致的行为和外观上的退行性变化，对于大鼠衰老现象过早的出现有积极的预防作用。

上世纪中叶，欧美的科学家提出了衰老的自由基学说，国内外许多科学家都将研究的重点放到了研究衰老、自由基的产生和细胞代谢之间的联系方面。很多的研究已经证实，生物体细胞膜内的脂肪酸过氧化和代谢垃圾自由基的产生是最终导致细胞受到破坏、机体出现衰老以及一系列相关慢性退行性疾病出现的重要原因之一[18,19]。而对生物体内最重要的抗氧化酶类之一超氧化物歧化酶（SOD）的活性，机体氧化代谢产物丙二醛（MDA）和脂褐素的含量和水平，经常用来直接评价机体氧化应激程度、自由基代谢水平和衰老程度的有效标志物[20,21]。

本研究结果显示，和C组相比，M组的大鼠骨骼肌组织的SOD活性、MDA和脂褐素的含量显著性升高，SOD/MDA比值下降但不明显。提示：随着研究时间的增加，大鼠体内自由基含量不断增多，而其清除能力在不断下降，机体出现一系列的氧化应激反应，引发大鼠衰老程度加深。但机体产生的过多氧自由基反而客观上刺激了骨骼肌组织内的抗氧化防御系统，引起SOD活性的提高，国内外的相关研究报道也证实了该结果[19,22]。其机理可能为：大量自由基的过量刺激可能激活了抗氧化酶的基因表达，或者骨骼肌细胞中的巯基储备量减少也会导致SOD活性的升高。

造模6周的过程中，运动干预组大鼠的骨骼肌组织SOD活性和SOD/MDA比值与M组相比显著性升高，MDA和脂褐素的含量显著性降低。并且以小负重组的作用效果更为明显。P组也出现了相似的趋势，这些与以往的一些研究基本一致[20,21]。除此之外，本研究发现，负重跑叠加补肽比单独一种方法更能够显著提高大鼠机体内自由基的清除能力和抗氧化酶的活性。其中的机理可能是：负重跑这种运动干预可以有效提高大鼠的物质和能量代谢的能力，推迟了 D-半乳糖注射造成的代谢紊乱情况，客观上提高了大鼠机体内清理自由基的能力，进而减慢了机体内氧化应激的程度；同时，活性肽的补充也可以有效调节大鼠机体的能量代谢。并且，两种运动和营养干预方法的叠加使用能够有效地增强 D-半乳糖衰老大鼠对抗自由基的能力。

相关文献表明，伴随着年龄的增加，有机体的激素代谢水平也会随之发生相应变化：胰岛素样生长因子（IGFs），生长激素（GH）和睾酮（T）等的含量会下降，皮质醇（C）等的含量会上升[23,24]。在体育科研实践过程中，通常采用测试血清T/C、T和C和来反映机体激素代谢水平的状况。

本研究的结果表明，和C组相比较，M组的大鼠血清中 T含量显著地下降，此结果与以往相关国内外文献报道基本一致[24,25]。提示：伴随大鼠衰老程度的加深，大鼠机体内分泌调节系统出现紊乱情况，导致激素代谢和调节能力降低，引起促进合成代谢的激素——T的分泌水平出现下降，可能的机制是：分泌控制轴——下丘脑-垂体-促性腺激素的分泌功能随着年龄的增加而衰减，睾丸本身也出现了细胞衰老的表现，尤其是Leydig细胞分泌开始减少，导致T的含量减少；同时，睾丸的血供随年龄的增加而减少，其中的曲精小管也发生了衰老性改变，间质细胞功能减退，从而导致分泌的 T的数量和质量下降。与 C组相比较，造模组大鼠的血清 C含量显著性上升，血清T的含量显著性降低，使T/C的比值出现显著性下降。这好像与之前的有些文献报道相矛盾。[26,27]其中可能的机制有：造模的过程中，大鼠体内物质代谢出现紊乱，间接影响了下丘脑-垂体-肾上腺内分泌轴（HPA）和下丘脑上级的大脑组织尤其是海马组织的分泌和调节功能，使有大鼠机体处于长期和慢性的氧化应激状态，HPA轴的调节功能持续性增强，最终出现大鼠血清C的含量增加。

进行 6周的负重跑训练或补肽能够显著地提高D-半乳糖衰老大鼠的血清T含量，降低血清C的含量，进而使T/C的比值提高，并以小负重跑组的效果更加显著。提示：长时间的补肽和负重跑训练和补肽都能够显著性地改善 D-半乳糖衰老大鼠的内分泌系统紊乱的状况，特别是可以有效地改善在机体物质代谢和能量代谢过程中发挥重要作用的C和T的分泌状况，负重跑训练叠加补肽比单独采用一种干预方法改善内分泌紊乱的效果更加显著。其中机理可能是：作为一种对骨骼肌有效的应激，负重跑训练是一种外在的机械性刺激，它可以改善下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴等神经调节通路的中枢调控作用，并且能够有效地改善骨骼肌组织的新陈代谢水平，并与有关的激素调节系统形成正向反馈作用，显著性地纠正了衰老大鼠机体内分泌紊乱的情况；而大豆多肽这样的优质植物蛋白质的补充，可以有效地纠正大鼠机体内蛋白质的负平衡状况，从而改善了大鼠骨骼肌组织中蛋白质的合成代谢能力。因此，两种运动和营养干预手段的叠加使用可以更加显著性地改善 D-半乳糖衰老大鼠的血清C和T的含量和水平。

作为一种有机体内重要的促进合成代谢的激素，GH对机体组织发挥生理作用主要是依靠IGF-I进行介导并完成的。相关文献资料显示，生物体年龄的增加对GH的分泌会产生消极的作用，而IGF-I代谢和含量水平的降低与机体的衰老程度密切相关。所以，血清中IGF-I含量和水平的变化常作为评价机体衰老的重要参考指标之一[26,28]。

本研究的结果表明，和C组相比较，M组的大鼠血清IGF-I和GH含量均显著性地下降，这与国内外的大多数文献报道的结果基本一致[26-28]。提示：随着大鼠衰老程度的加深，机体内激素代谢和物质代谢出现紊乱的状况，引发GH的分泌量降低，从而导致与其关系密切的IGF-I的分泌量也随之降低。其可能的机制是：随着年龄的增加，会导致 GH—IGF-I和生长激素释放激素—生长抑素两个激素调节轴的功能下降，生长激素结合蛋白的水平和周边组织中生长激素的受体含量及活性紧接着出现降低，间接地引起胰岛素样生长因子的结合蛋白含量和活性也出现下降；同时，机体衰老还会引起分泌IGF-I的主要器官，如骨骼肌、肝、肾等的功能出现减退，胰岛素和甲状腺激素等激素的正向调节能力随之下降。

和M组的大鼠相比较，S组和B组大鼠的血清GH和IGF-I的水平均显著性地升高，P组也出现了相同的升高趋势。负重跑这种运动训练的干预叠加补肽的这种营养干预的方法比使用单一干预方法更可以显著性地改善 D-半乳糖的衰老大鼠机体GH—IGF-I轴的主动调节功能。其可能的机制是：对大鼠骨骼肌组织刺激量较大的负重跑训练，可以有效地改善因为机体衰老导致的生长激素释放激素——生长抑素和 GH—IGF-I两个激素调节轴功能下降的情况，并且提高和改善了生长激素释放激素的分泌状况，并促进了GH分泌的积极性调节，导致血清GH的含量和水平得到提高和改善。并且，这种运动干预可以使IGF-I的结合蛋白及其受体的含量和活性得以提高，辅助于类似于GH等激素的正向调节作用，最终使血清IGF-I的含量和水平也得到了相应提高和增强。而大豆多肽的营养补充，不仅可以提高IGF-I受体和胰岛素样生长因子结合蛋白的活性和含量，还会对IGF-I的自分泌、旁分泌和内分泌产生积极和有效地促进作用，最终使血清IGF-I的水平得以提高。但是，营养干预对IGF-I和GH分泌水平及其激素调节轴的影响作用不及负重跑训练，从而表现出补肽组的效果不及负重跑组。同时，两种运动和营养两种干预手段的叠加使用可以更加显著性地改善 D-半乳糖的衰老大鼠血清IGF-I和GH的含量和水平。

4 结论

采用本研究的实验方法，进行长达6周D-半乳糖的注射，可以成功地复制大鼠的亚急性骨骼肌衰老模型。在造模同时，进行大豆多肽的营养补充或负重跑的运动训练干预，均能够显著性地改善大鼠骨骼肌组织中自由基代谢和激素代谢紊乱的情况，并以小负重跑运动训练的效果最好，两种干预手段叠加使用的效果更为显著。其中可能的作用机制是：骨骼肌组织的氧化应激程度得以减轻，机体自由基的生成得以减少，激素代谢和相关因子代谢水平的紊乱状况得以纠正等。

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The Study of the Effect in Free Radical and Hormone Metabolism of Aging Rat Skeletal Muscle by Weight Training and Soy Polypeptide Supplement

LIU Feng-bin
(College of Physical Education, Dalian University, Dalian 116622, China)

To study of the effect in free radical and hormone metabolism of aging rat skeletal muscle by weight training and soy polypeptide supplement. 56 male SD rats were divided into 7 groups randomly: Control, Model,small load running, big load running, peptide, peptide-small load running, and peptide-big load running. Observed changes of rats‘ appearance in the experiment process every day. The rats were killed after 6 weeks, tested serum, as well as indicators of skeletal muscle. All the model rats showed up the aging appearances in different extent, weight training and soy polypeptide supplement could mitigate this phenomenon in some extent; Compared with Group C,the content of SOD, MDA and Lipofuscin in skeletal muscle of Group M were higher, however, the ratio of SOD/MDA was in decrease tendency and had no difference statistically, load running or the supplement of soy polypeptide could make the SOD in skeletal muscle in a further increase and reverse others tendency, the Group S had much more obvious appearance in most cases, moreover, the above two interventions have significant interaction;Compared with group C, the serum T, GH and T/C in group M were lower, C were higher, but the IGF-I of serum was in a decrease tendency and had no statistical difference, load running or the supplement of soy polypeptide could delay this tendency, group S had much more obvious appearance in all, and the above two interventions have significant interaction. Load running or soy polypeptide supplement can improve the indiscriminate condition in free radical and hormone metabolism in skeletal muscle of aging rats effectively, the running of small load has even the best result, the way combined two interventions together can have much more obvious effects.

load running; soy polypeptide; skeletal muscle; free radical; hormone; aging

R87

A

1008-2395(2017)03-0075-07

2017-04-12

大连市科技局科技计划项目（2010E15SF165）；大连大学博士科研基金项目（0302294）。

刘丰彬（1981-），男，副教授，博士，研究方向：体育健康促进的理论与应用。