肿瘤坏死因子α突变型斑马鱼在海分枝杆菌感染中的应用研究

谢玲玲，王风华，王德成，赵超，彭刚，牛辰

1. 复旦大学基础医学院医学分子病毒学教育部/卫生部重点实验室，上海 200032； 2. 复旦大学脑科学研究院，上海 200032； 3. 三峡大学医学院，宜昌 443002



·论著·

肿瘤坏死因子α突变型斑马鱼在海分枝杆菌感染中的应用研究

谢玲玲1，王风华2，王德成3，赵超1，彭刚2，牛辰1

1. 复旦大学基础医学院医学分子病毒学教育部/卫生部重点实验室，上海 200032； 2. 复旦大学脑科学研究院，上海 200032； 3. 三峡大学医学院，宜昌 443002

肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor α，TNF-α)作为重要的炎性细胞因子，在类风湿关节炎、感染性休克等疾病的发病中起重要作用。为探究TNF-α在宿主抵抗海分枝杆菌感染中的作用，本研究采用成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9〔clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)，CRISPR/Cas9〕技术，使野生型斑马鱼TNF-α基因发生突变，成功构建并筛选出含有移码突变的TNF-α突变型(TNF-α-/-)斑马鱼。利用原位杂交技术，发现TNF-α-/-斑马鱼中TNF-α mRNA表达水平显著降低。与野生型斑马鱼相比，海分枝杆菌在TNF-α-/-斑马鱼体内扩散和增殖更显著。结果提示，本研究成功构建TNF-α-/-斑马鱼，有助于深入探究TNF-α在斑马鱼抵抗海分枝杆菌感染中的作用及其免疫调节机制。

成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9；肿瘤坏死因子α；突变型斑马鱼；原位杂交；细菌感染

肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)最早由 Carswell等在接种卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)的小鼠中注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)后，于血清中发现的一种能杀伤某些肿瘤细胞或使体内肿瘤组织发生出血坏死的因子[1]。由巨噬细胞产生的TNF命名为TNF-α，其在细胞生长调控、细胞分化、炎症、病毒复制、肿瘤、自身免疫疾病等方面发挥重要作用，可对抗病毒、细菌、真菌引起的感染[2-6]。病原菌感染宿主后，免疫识别系统通过巨噬细胞和树突细胞中Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)及NOD2激活TNF-α，继而发挥以下作用：吞噬细胞分泌TNF-α并激活其他细胞因子；γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)和TNF-α可作为协同剂诱导产生NO，参与细胞凋亡；同时TNF-α可参与细胞自噬[7]。TNF-α也是宿主抗结核免疫中最早被发现的关键因子之一。缺失TNF-α或相关受体的小鼠对结核分枝杆菌的易感性增加[8]。斑马鱼具有体型小、易养殖、饲养成本低、便于开展大规模研究的优点，且其胚胎透明，便于活体实时观察。斑马鱼作为海分枝杆菌(Mycobacteriummarinum，M.marinum)的天然宿主，具有先天性和适应性免疫系统[9]，且体内存在典型的免疫细胞，包括巨噬细胞、粒细胞、T和B细胞等[10]。斑马鱼可在适应性免疫还未发挥作用的早期发育阶段被感染，因此可利用其具有光学透明性的胚胎展示巨噬细胞的存在和活动[11]。经尾静脉或后脑室注射荧光细菌至受精后32～48 h的斑马鱼胚胎，可清楚观察斑马鱼早期发病症状[12]。在一定时间内，巨噬细胞到达感染部位并吞噬细菌，然后迁移至更深的组织，形成有组织的肉芽肿状集合体[7]。海分枝杆菌可在被感染斑马鱼的巨噬细胞中增殖，并造成慢性肉芽肿感染[9-10]；其感染成年斑马鱼后可产生结核样疾病，可见类似典型人类结核病的干酪性肉芽肿[11]。近年来，斑马鱼-海分枝杆菌模型作为结核病的研究模型得到广泛认可。随着基因组注释和技术的发展，包括突变体诱变[13]、吗啉环寡核苷酸、mRNA过量表达、转基因斑马鱼[14]、锌指核糖核酸酶(zinc finger nuclease，ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)基因敲除[15]等技术在内的相关遗传操作手段日臻完善，斑马鱼作为脊椎模式动物在全世界范围内得到了更广泛的应用。2013年Hruscha等[16]采用Cas9 mRNA和基因特异的引导RNA(guide RNA，gRNA)，实现了斑马鱼基因组特定基因位点缺失或插入的靶向突变Cas9对基因读码框序列破坏的高效性，使在短时间内建立稳定可遗传的突变斑马鱼品系成为可能[17]。

本研究旨在采用CRISPR/Cas9技术构建 TNF-α-/-斑马鱼，利用海分枝杆菌这一模式菌感染斑马鱼幼鱼模型，研究TNF-α基因在被感染斑马鱼体内的作用，从而为研究TNF-α信号转导在抵御细菌感染中的机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 海分枝杆菌M菌株(ATCC BAA-535TM)由多伦多大学刘军教授馈赠，最早由Lalita Ramakrishnan博士分离。pTEC15质粒由英国剑桥大学Lalita Ramakrishnan教授惠赠[18]，其带有Wasabi基因编码的绿色荧光蛋白。本研究将pTEC15质粒经电转法转入海分枝杆菌野生菌株，获得带有绿色荧光标记的海分枝杆菌。

1.1.2 实验动物 AB品系野生型斑马鱼购自国家斑马鱼资源中心，自行繁育后代，饲养于28 ℃循环水系统中。

1.1.3 仪器和试剂 主要仪器包括Zeiss Axiovert 200M倒置显微镜(Carl Zeiss)、FemtoJet®显微注射系统(Eppendorf)、2720 Thermal Cycler常规聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仪(Applied Biosystems)。主要试剂有PrimeSTAR酶(TaKaRa)、TaKaRa PrimeScript®RT reagent Kit(TaKaRa)、三卡因、PTU(Sigma-Aldrich)、TRIzol(Life Technology)。碱性裂解液：5 g NaOH与0.2 mL 10 mol/L乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)定容至1 L去离子水中。裂解中和液：6.3 g Tris-HCl定容至 1 L去离子水中。地高辛标记核糖核酸混合物、偶联碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(cat#11093274910)、蛋白酶K(cat#18501)、NBT/BCIP检测试剂盒(cat#11184920)、甲酰胺(cat#11184320001)购自Roche，多聚甲醛(cat#18501 )购自Ted Pella，T7转录试剂盒购自Ambion，酵母tRNA(R6625)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)(A3924)、肝素(H3393)、焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC)购自Sigma，RNA纯化试剂盒购自Thermo。

1.1.4 引物设计与合成 根据美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)数据库公布的斑马鱼TNF-α基因序列(GenBank accession number: NM_212859)，利用Primer-BLAST进行PCR引物设计。斑马鱼TNF-α基因Cas9 mRNA上游引物：5′-CATTTTGGCTGTGGGCCTTT-3′，下游引物5′- GAACCGCCACAGTAAACCAG-3′。斑马鱼TNF-α基因gRNA：上游引物5′-ATAGGCAA-TCAACAAGATGGAAGGT-3′，下游引物5′- TAAAACCTTCCATCTTGTTGATTGCC-3′。斑马鱼TNF-α基因测序引物：上游引物5′-GGCGTTTTTGGATGTTGAAG-3′，下游引物5′-AGATCGCATTTCACAAGGCAA-3′。斑马鱼原位杂交探针上游引物：5′-CCATCGATATGAA-GCTTGAGAGTCG-3′，下游引物：5′-TATTATG-TGCAACTGGGGATCCCG-3′。引物合成及DNA测序均由华大基因(上海)完成。

1.2 方法

1.2.1 海分枝杆菌的培养 海分枝杆菌划线于M7H10-10% OADC (DIFCO)平皿，30 ℃避光密封培养10 d，挑取单个菌落接种于M7H9-10% OADC液体培养基，30 ℃避光旋转培养(100 r/min)。OADC配制方法：0.6 g油酸(Sigma)、0.6 mL 6 mol/L NaOH、50 g BSA组分V(Fisher)、20 g葡萄糖、8.5 g NaCl、30 mg触酶，溶于1 L预冷去离子水中，0.2 μm滤器无菌过滤，避光保存于4℃。

1.2.2 斑马鱼的养殖 斑马鱼饲养于28 ℃循环水系统中，自行繁育。受精后5 d(5 days post fertilization，5 dpf)，斑马鱼胚胎可于培养皿中培养，密度不超过50个胚胎/培养皿(90 mm)，无需喂食。从5～15 dpf每天喂食轮虫2～3次。1个月大的斑马鱼可放入水循环系统，每天喂食丰年虾2～3次。从孵育到养殖保证水环境洁净。

1.2.3 TNF-α-/-突变鱼系的构建和筛选 按已有文献[19]，采用CRISPR/Cas9技术构建TNF-α突变斑马鱼品系。首先，针对TNF-α基因的外显子DNA序列，利用BLAST软件在 Ensembl 网站上查找Cas9作用的靶位点，并验证其为斑马鱼基因组中的单一位点。依据靶位点设计并合成Cas9 mRNA和gRNA引物，体外合成Cas9 mRNA和gRNA。将Cas9 mRNA(800 ng/μL)和gRNA(30 ng/μL)按1∶1混合，注射到野生型斑马鱼单细胞期胚胎中。2～4 d后，取20个左右鱼卵，提取基因组DNA，测序鉴定突变发生率。将同批次注射的F0胚胎养至性成熟后，与野生型斑马鱼外交，对所产胚胎进行基因组测序，挑选有效突变的母本大量外交，获得更多F1代。对其中携带同种突变的斑马鱼进行分组，筛选出的突变类型至少各保留两雄两雌，对理想的突变类型进行保种。在测序筛选F1代时保留有效突变的杂合个体，在测序筛选F2代时保留有效突变的纯合个体。经9个月，成功获得可产卵的TNF-α-/-纯合突变斑马鱼品系。

1.2.4 斑马鱼TNF-α基因测序 用碱裂法提取基因组DNA：将成鱼置于0.016%三卡因麻醉液中，待鱼麻醉后用消毒的解剖剪剪下尾部尖端少量组织，置于1.5 mL 离心管中，尽量不留液体。在样品管内加入50 μL碱性裂解液，95 ℃孵育30 min，加入50 μL裂解中和液，振荡混匀，3 000 r/min离心5 min。DNA扩增：取上清液2 μL作为50 μL PCR体系的反应模板，利用TNF-α测序引物进行扩增。扩增条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 5 min，35个循环。扩增产物送华大基因(上海)测序，测序结果用4Peaks软件分析。

1.2.5 地高辛标记的TNF-α反义RNA探针制备 收集14 dpf野生型斑马鱼幼鱼15条，置于1.5 mL EP管中，TRIzol法提取总RNA[20]。以抽提的斑马鱼总RNA为模板，进行反转录PCR，获得cDNA，以其为模板用原位杂交引物扩增TNF-α基因，使DNA片段囊括碱基缺失位点。PCR产物经凝胶电泳后回收。将回收产物片段及pBluescript®KS质粒分别用ClaⅠ和BamH Ⅰ双酶切，经电泳切胶回收后，用T4 DNA连接酶进行连接，连接产物由华大基因(上海)测序验证。将TNF-α-pBluescript®KS重组质粒作为模板，用SmaⅠ线性化，T7转录试剂盒进行体外转录，最终获得地高辛标记的TNF-α反义RNA探针。用RNA纯化回收试剂盒纯化探针，最终浓度为113 ng/μL。

1.2.6 斑马鱼全胚胎原位杂交 选择48 hpf的斑马鱼，用1 mL注射器针头进行截尾，多聚甲醛固定截尾2 h后的全胚胎鱼，作为全胚胎原位杂交的实验对象。按标准原位杂交流程进行实验[21]。经脱水、预杂交，加入制备好的地高辛标记的TNF-α反义RNA探针杂交液，杂交过夜。洗脱完全后，将碱性磷酸酶偶联抗地高辛抗体以1∶7 000的比例稀释入封闭液，取800～1 000 μL加入胚胎鱼中，4 ℃摇床过夜。最后加入NBT/BCIP溶液显色，染色2 d后，可于显微镜下观察到蓝色的阳性杂交信号。

1.2.7 海分枝杆菌感染及细菌增殖检测 检测方法参照文献[18]。收集TNF-α-/-和野生型斑马鱼的受精卵，待发育至28～30 h，用5号镊子在体视镜下拨开卵黄膜，帮助斑马鱼幼鱼孵出。斑马鱼浸泡于0.016%三卡因中进行麻醉。将0.5 μL高浓度酚红溶液(0.2 g/mL)加至10 μL海分枝杆菌的荧光单细菌悬液中(约2×108CFU/mL)[22]。用上样管吸取3 μL混匀细菌，加入直径1 mm的厚壁注射毛细针里。将上好样品的毛细针插入持针器中固定，用尖头镊子将注射针的前端夹断。通过调节针尖大小、注射时间及压力，调节注射剂量，一般注射剂量为1 nL，并铺板计数。根据需要选择不同的初始感染量，感染样本以30条左右斑马鱼为一组。定期更换培养液，保证胚胎的存活率。注射感染后第1、3、5天，于荧光显微镜下观察斑马鱼体内细菌的扩散和增殖情况并拍照。收集荧光照片，用ImageJ软件分析并统计荧光光密度(optical density，OD)[23]。

2 结果

2.1 基因测序验证TNF-α基因突变

剪取适量2月龄TNF-α-/-和野生型斑马鱼尾鳍，碱裂法提取基因组。对TNF-α基因进行PCR扩增及测序，用4Peaks软件比对分析基因序列。斑马鱼TNF-α基因有4个外显子、3个内含子。DNA全长5 488 bp，cDNA长1 048 bp。测序分析结果证明，基因缺失位点在第2个外显子的最后5个碱基及第3个内含子的第1个碱基(图1)。保留该突变类型并繁育，最终从121条杂合母本产出的后代中筛选出20条纯合TNF-α-/-斑马鱼。

A: The schematic of TNF-α gene, including four exons (red rectangle) and three introns (blue line). The black box indicates the location of deletion sites of TNF-α-/-. B: The sequences of wild-type (WT) and TNF-α-/-. The green bases represent the target sites, the underlined bases represent the exon, and the others are intron. The deletion is labeled in the red box, which includes the last five bases of the second exon and the first base of the third intron.

图1 TNF-α-/-和野生型斑马鱼基因测序结果及碱基缺失位置示意图

Fig.1 The schematic of gene sequences of TNF-α-/-zebrafish and wild-type zebrafish, and the location of deletion sites

2.2 TNF-α-/-斑马鱼中TNF-α mRNA表达水平显著降低

利用带标签的反义RNA探针可检测斑马鱼组织内源性转录本的原始分布及相对表达水平[24-25]。本研究通过原位杂交方法检测损伤后的TNF-α-/-和野生型斑马鱼中TNF-α mRNA的表达量。对TNF-α-/-和野生型斑马鱼(48 hpf)进行尾鳍损伤实验，观察2 h后原位杂交染色情况(图2)，发现在尾部损伤处TNF-α-/-斑马鱼较野生型斑马鱼TNF-α mRNA表达水平显著降低。

TNF-α mRNA expression (blue shadow) was detected byinsituhybridization using TNF-α anti-sense probe, at 2 hpf amputated fins from 48 hpf wild-type zebrafish (A) and TNF-α-/-zebrafish (B). Compared with wild-type zebrafish, less blue area was observed in the tail of wounded TNF-α-/-zebrafish.

图2 尾部损伤后TNF-α-/-和野生型斑马鱼的原位杂交结果

Fig.2 Theinsituhybridization results of wounded TNF-α-/-zebrafish and wild-type zebrafish

2.3 TNF-α基因突变降低斑马鱼成鱼存活率

随机收集24 hpf的TNF-α-/-和野生型斑马鱼胚胎各200个，比较两组胚胎的死亡情况。实验重复3次。统计结果显示，TNF-α-/-和野生型斑马鱼的胚胎孵育率均在正常范围内，TNF-α-/-斑马鱼孵育率为93.75%，野生型斑马鱼为93.05%(图3)。结果表明，TNF-α基因突变不影响斑马鱼受精卵的孵化率。

The embryo survival rate of TNF-α-/-zebrafish was the same as wild-type zebrafish. Incubation rate of TNF-α-/-zebrafish was 93.75%, and wild-type zebrafish 93.05%.

图3 TNF-α-/-和野生型斑马鱼的胚胎存活率

Fig.3 The embryo survival rate of wild-type zebrafish and TNF-α-/-zebrafish

进一步收集发育至2～3月龄的TNF-α+/-杂合突变斑马鱼的自交后代121条，进行基因型鉴定。其中有20条纯合突变个体，占16.5%；38条野生纯合个体，占31.4%。结果提示，发育过程中TNF-α-/-斑马鱼的存活率较野生型斑马鱼低。

2.4 TNF-α突变导致斑马鱼抑制海分枝杆菌体内增殖的能力减弱

为检测TNF-α基因突变是否影响斑马鱼抵抗细菌感染的能力，用海分枝杆菌分别感染孵育后30 h的TNF-α-/-和野生型斑马鱼(斑马鱼成鱼既有天然免疫又有适应性免疫，而实验期斑马鱼幼鱼只有天然免疫[26])，每组25条左右。图4A为荧光定量分析细菌感染TNF-α-/-和野生型斑马鱼鱼体1、3、5 d后的扩散及增殖情况。初始感染菌量为每条鱼130 CFU。结果显示，感染后第1、3天，海分枝杆菌在TNF-α-/-与野生型斑马鱼体内增殖差异不明显。感染后第5天，海分枝杆菌在TNF-α-/-斑马鱼体内的增殖速率显著高于野生型斑马鱼(图4A)。图4B和4C为分别选择一条TNF-α-/-和野生型斑马鱼感染海分枝杆菌后第4天的代表图，箭头所示为斑马鱼体内带有绿色荧光的细菌。TNF-α-/-斑马鱼体内绿色细菌扩散范围更广，巨噬细胞吞噬细菌后形成的肉芽肿也更明显。

Zebrafish larvae were infected withM.marinumcarrying pTEC15 containing fluorescent protein Wasabi separately. The bacteria in TNF-α-/-and wild-type zebrafish infected withM.marinumseparately at 1, 3, 5 dpi were quantified (A).OD= lg255/PixelValue.****P≤0.000 1 (calculated by Kruskal-Wallis test and Dunn’s multiple comparison test). Representative fluorescent images of infected larvae of TNF-α-/-zebrafish (B) and wild-type zebrafish (C) at 4 dpi were shown (the head and tail of the same fish). The arrow points to the formation of initial granuloma with fluorescentM.marinuminside. The bacteria in TNF-α-/-zebrafish spread faster, diffused more deeply.

图4 海分枝杆菌在TNF-α-/-和野生型斑马鱼体内的扩散和增殖

Fig.4 Bacteria in TNF-α-/-and wild-type zebrafish infected withM.marinum

3 讨论

本研究利用 CRISPR/Cas9基因编辑技术，对斑马鱼TNF-α基因进行突变，获得了在TNF-α基因第2个外显子最后5个碱基及第3个内含子首个碱基缺失的TNF-α-/-斑马鱼，并通过基因测序验证了TNF-α基因的具体突变位点；此外，利用原位杂交技术，证明了TNF-α-/-与野生型斑马鱼TNF-α基因表达水平存在差异。

在筛选纯合TNF-α-/-斑马鱼过程中，TNF-α基因突变不影响斑马鱼胚胎孵化的能力。但在斑马鱼个体从胚胎发育至成鱼的生命过程中，随着幼鱼的生长发育，TNF-α-/-斑马鱼存活率低于野生型斑马鱼。由此推测，饲养斑马鱼的水环境中存在微生物，而斑马鱼TNF-α基因突变可能影响了宿主的抗菌免疫，导致在长期生长过程中TNF-α-/-斑马鱼存活率下降。

TNF-α在抵抗多种细胞内病原体(包括致病性分枝杆菌)的免疫过程中起关键作用。通过海分枝杆菌感染实验，发现感染后第4天TNF-α-/-斑马鱼体内肉芽肿形成和聚集更明显，第5天TNF-α-/-斑马鱼体内细菌扩散范围更广。有研究发现，TNF-α在肉芽肿的形成和维持中发挥重要作用[27]。在TNF-α活性缺乏的小鼠体内，肉芽肿形成存在缺陷，各种组织中的肉芽肿数目减少[28]，体积较小[29]，且缺乏细胞组织特征性结构[30]。肉芽肿结构的维持取决于多种因素，包括细胞活力、细胞黏附蛋白水平、趋化因子梯度和趋化因子受体表达，TNF-α可通过调节这些因素而在维持肉芽肿结构过程中发挥重要作用。小鼠模型中，TNF-α可导致感染的巨噬细胞和其他CD11b+T细胞分泌的趋化因子减少，从而影响细胞迁移进入和离开肉芽肿的能力[31]。

本研究显示，在海分枝杆菌感染TNF-α-/-和野生型斑马鱼后第1天，两者体内细菌增殖差异不明显，直至感染后第5天出现显著差异，提示TNF-α基因可能通过影响肉芽肿结构的维持以控制斑马鱼体内海分枝杆菌的增殖，与Clay等利用斑马鱼胚胎的活体成像追踪海分枝杆菌在巨噬细胞中的运动所发现的结果一致[32]。他们的数据显示，在细菌感染后第4天用RNA干扰技术阻断TNF信号通路的斑马鱼胚胎中，形成活动期肉芽肿的比例为60%，显著高于对照组的35%。他们认为TNF-α信号转导并非作用于肉芽肿的最初形成，而是将未感染的巨噬细胞募集至初始感染位置，并聚集未感染和感染的巨噬细胞形成肉芽肿。因此，TNF-α信号转导促进巨噬细胞在肉芽肿内的存活，可能是限制分枝杆菌扩散的主要机制，从而控制感染的进一步传播。本研究发现，海分枝杆菌在TNF-α-/-斑马鱼体内扩散范围更广，巨噬细胞吞噬细菌后形成的肉芽肿更明显。这可能是由于TNF-α基因突变影响了TNF-α 信号转导通路，导致肉芽肿巨噬细胞干酪样坏死，释放活细菌，然后扩散到相邻细胞。

借助TNF-α-/-斑马鱼模型，利用其可视化、光学透明的胚胎，可在适应性免疫未发生时观察TNF-α基因对新生肉芽肿中病原菌生长的控制及对巨噬细胞功能的影响。相较于其他结核病动物模型，斑马鱼模型的优势之一是利用其光学透明的胚胎可在早期发病阶段实时追踪细菌在宿主体内的感染过程，确定细菌与宿主发生相互作用的具体阶段[23]。相较于通过改变mRNA剪接或抑制蛋白翻译来瞬时阻断斑马鱼基因功能的方法[32]，CRISPR技术突变斑马鱼TNF-α基因而建立的基因修饰作用是可遗传的，这将大大提升实验的可重复性和精确性，并为大规模、大批次通过斑马鱼模型研究TNF-α基因的功能提供了便利。

本研究利用CRISPR技术成功构建了TNF-α-/-斑马鱼，发现TNF-α基因突变影响斑马鱼抗菌免疫，显著削弱了宿主对抗分枝杆菌感染的能力。这一模型的建立和特征刻画，有助于进一步研究TNF-α信号转导在斑马鱼生长发育、生命活动及宿主抵抗海分枝杆菌感染中的作用。

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s. NIU Chen, E-mail: chniu@fudan.edu.cn; PENG Gang, E-mail: gangpeng@fudan.edu.cn

Application of tumor necrosis factor α mutant zebrafish inMycobacteriummarinuminfection

XIE Lingling1, WANG Fenghua2, WANG Decheng3, ZHAO Chao1, PENG Gang2, NIU Chen1

1. Key Laboratory of Medical Molecular Virology, Ministries of Education and Health, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China; 2. Institutes of Brain Science, Fudan University, Shanghai 200032, China; 3. Medical College of China Three Gorges University, Yichang 443002, China

Tumor necrosis factor α(TNF-α) is an important inflammatory cytokine implicated in the pathogenesis of rheumatoid arthritis, septic shock and other diseases. In order to investigate the functional role of host TNF-α inMycobacteriummarinum(M.marinum) infection, clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) (CRISPR/Cas9) technology was utilized to mutate the TNF-α gene in wild type (WT) zebrafish. A zebrafish containing a frame-shift mutation was successfully constructed, isolated, and named as TNF-α-/-. It was found that the expression of TNF-α mRNA was significantly reduced in TNF-α-/-zebrafish byinsituhybridization (ISH). The proliferation ofM.marinumin TNF-α-/-zebrafish was significantly elevated compared to WT zebrafish. The construction of TNF-α-/-zebrafish will allow further in-depth study on the function of TNF-α in mycobacterial infection and related immune regulation.

Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9; Tumor necrosis factor α; Mutant zebrafish;Insituhybridization; Bacterial infection

上海市科学技术委员会科研计划项目(14140902900)

牛辰，彭刚

2016-12-02)