炭疽芽胞杆菌A16D2株BA2380基因缺失突变株的构建

贾书骅，陈楠，王东澍，王甜甜，冯尔玲，朱力，王恒樑，彭清忠，刘先凯

1. 吉首大学，吉首 416000； 2. 军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071； 3. 沈阳师范大学化学与生命科学学院，沈阳 110034



·论著·

炭疽芽胞杆菌A16D2株BA2380基因缺失突变株的构建

贾书骅1,2,*，陈楠2,3,*，王东澍2，王甜甜2，冯尔玲2，朱力2，王恒樑2，彭清忠1，刘先凯2

1. 吉首大学，吉首 416000； 2. 军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071； 3. 沈阳师范大学化学与生命科学学院，沈阳 110034

本课题组早期研究结果表明，炭疽芽胞杆菌BA2380蛋白可能与炭疽芽胞杆菌毒力有关，因而有必要对其功能进行深入研究。选取炭疽芽胞杆菌A16D2株为出发菌株，以其BA2380基因为目的缺失基因，参照A16D2株基因组序列及质粒pSET4s序列，利用软件设计上下游同源臂及抗性基因引物，用本实验室改造的“Golden Gate”克隆方法将3个片段同时连入温敏型穿梭载体pKMBK中(本实验室构建的受体质粒)，从而构建基因打靶质粒。将该基因打靶质粒导入炭疽芽胞杆菌A16D2感受态细胞中，利用同源重组原理，筛选获得炭疽芽胞杆菌A16D2BA2380基因缺失突变株，并对其进行验证。结果验证了本课题组构建的“Golden Gate”克隆体系进行多片段克隆的高效性，也为后续探索其基因功能奠定了基础。

炭疽芽胞杆菌；Golden Gate克隆；基因替换；同源重组

炭疽芽胞杆菌(Bacillusanthracis，B.anthracis)是炭疽的病原体。其无鞭毛，有荚膜，属革兰阳性菌。炭疽是由炭疽芽胞杆菌引起的人畜共患病，危害性极强，对人类健康及畜牧业构成严重威胁。芽胞是炭疽芽胞杆菌传播和感染的主要形式，其接触皮肤伤口、消化道或呼吸道上皮后，引起感染并导致皮肤炭疽、肠道炭疽、肺炭疽等疾病[1-4]。2001年美国炭疽邮件事件的发生[5]，使人们认识到如果将炭疽芽胞杆菌的芽胞用于生物恐怖袭击会对社会稳定构成巨大威胁。此外，由于炭疽芽胞杆菌的芽胞具有制备方法简单、可长时间保存、易于雾化形成气溶胶、抗逆性强等特点，目前一些国家还将其作为生物武器来储备[6]。因此，炭疽芽胞杆菌相关研究一直广受关注。

本研究中的目标蛋白BA2380是碱性丝氨酸蛋白酶。根据文献报道[7]，炭疽芽胞杆菌中的丝氨酸蛋白酶如htrA对其毒力的发挥必不可少。本课题组早期研究结果显示，该蛋白在炭疽芽胞杆菌A16D2(pXO1+，pXO2-)中表达上调，在A16D1(pXO1-，pXO2+)和A16DD(pXO1-，pXO2-)菌株中表达下调，表明BA2380的表达受毒力大质粒调控，可能与炭疽芽胞杆菌的毒力有关。本研究(严格按照生物安全规定操作)采用同源重组方法敲除炭疽芽胞杆菌A16D2(pXO1+，pXO2-)染色体上的BA2380基因，获得带抗性的缺失突变株A16D2ΔBA2380∷spc，不仅证明本课题组构建的“Golden Gate”克隆体系在将多DNA片段克隆入一个载体中的简便性和高效性，还为BA2380后续的功能研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)DH5a感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司，JM110感受态细胞为本室保存；炭疽芽胞杆菌A16D2为本室通过质粒不相容原理构建；pKMU7质粒为本室构建，其来源质粒为pKSV7，是大肠埃希菌-枯草芽胞杆菌穿梭质粒，温度敏感型，高拷贝，含有氨苄西林(ampicillin，Ap)抗性和氯霉素(chloramphenicol，Cm)抗性基因，为本室保存；pT-loxp∷spc质粒，具有大观霉素(spectinomycin，Spc)抗性。为能进行以Ⅱs型限制性内切酶BsaⅠ为基础的“Golden Gate”克隆方法，将pKSV7质粒中一个内部BsaⅠ位点突变，从而获得不含有BsaⅠ位点的pKSV7，命名为pKMU7(表1)。

1.2 主要试剂及引物

DNA聚合酶购自TaKaRa公司，限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)产物回收试剂盒购自北京博迈德生物技术有限公司，细菌基因组提取试剂盒、T-easy试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，Ap、Cm、Spc购自天根生化科技(北京)有限公司，溶菌酶购自生工生物工程(上海)股份有限公司，蛋白胨、酵母提取物购自英国Oxoid公司，脑心浸液(brain heart infusion broth，BHI)购自美国BD公司，同源重组酶和T4 DNA连接酶购自金斯瑞生物科技有限公司。引物合成(表2)和DNA测序由天一辉远生物科技有限公司完成。使用Primer Premier 5.0软件，根据pT-loxp∷spc质粒序列设计扩增spc序列的引物，根据炭疽芽胞杆菌A16D2株染色体上BA2380基因上下游序列，设计其上下游同源臂序列的引物(表2)。在UP-F/R、DN-F/R和Spc-F/R的两端均含有BsaⅠ位点及设计好的4碱基突出接头。

1.3 重组质粒pK2380usd(pKMU7+BA2380UP+Spc+BA2380DOWN)的构建

1.3.1 供体质粒构建 以pT-loxp∷spc质粒为模板，以Spc-F和Spc-R为引物，用Pyrobest DNA聚合酶扩增spc；以A16D2基因组为模板，以UP-F/R和DN-F/R为引物，用Pyrobest DNA聚合酶扩增BA2380基因上下游同源臂(分别称为UP片段和DOWN片段)。PCR条件如下：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。反应体系为50 μL，用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。扩增的3个片段两端均含有一个BsaⅠ位点。用PCR回收试剂盒回收扩增产物。纯化回收的3个片段(UP、DOWN和Spc)，分别与T-easy载体相连，构建3个重组质粒(供体质粒)，用菌落PCR筛选阳性克隆，测序确认构建是否成功。将验证正确的重组载体分别命名为UP-T、DN-T和Spc-T。

1.3.2 受体质粒构建 受体质粒pKMBK为本室构建，过程简述如下。为能在炭疽芽胞杆菌中进行基因替换操作，选用大肠埃希菌-枯草芽胞杆菌穿梭质粒pKSV7为出发质粒。首先对其全序列进行分析，发现一个BsaⅠ位点，为防止以后的酶切-连接体系中在此位点进行酶切，用点突变试剂盒使该位点突变，获得一个不含BsaⅠ位点的质粒pKMU7。为使后期实验能进行蓝白斑筛选，将一个表达β-半乳糖苷酶的基因bgaB(受一个组成型启动子plcpB的调控)插入pKMU7多克隆位点中，在plcpB-bgaB的两端插入BsaⅠ位点。这样，在克隆体系中如果发生外源片段替换plcpB-bgaB，克隆会显示白色，否则为蓝色。为能进行抗性筛选，需使受体质粒与供体质粒含有不同的抗性基因，本研究中使用的T-easy载体和pKMU7载体均为Ap抗性，因而将一个卡那霉素基因插入pKMU7中，成功构建受体质粒pKMBK。

表1 本研究相关质粒和菌株

Tab.1 Strains and plasmids used in the experiment

StrainorplasmidRelevantgenotypeandcharacteristicsSourcepKSV7Shuttlevector,temperature-sensitive,AmprinE.coliandCmrinB.anthracis[8]pKMU7DerivedfrompKSV7bydestroyingaBsaⅠsiteinitThislabpMADShuttlevector,AprinE.coliandEmrinB.substilis,containingpclpB-bgaBfragment[9]pKD4ContainingkanamycinresistantgeneThislabpKMBKpclpB-bgaBfrompMADandkanamycinresistantgenefrompKD4wereclonedintandeminpKMU7ThislabUP-TTheupstreampartofthetargetgeneBA2380flankedwithBsaⅠenzymerec-ognitionsiteinsertionintoT-easyvectorThisworkDN-TThedownstreampartofthetargetgeneBA2380flankedwithBsaⅠenzymerecognitionsiteinsertionintoT-easyvectorThisworkSpc-TThespectinomycinresistancegeneflankedwithBsaⅠenzymerecognitionsiteinsertceintoT-easyvectorThisworkpK2380usdThethreeDNAfragmentsofUP-T,Spc-TandDN-TwereclonedintandemintotheacceptorvectorpKMBKusing“GoldenGate”cloningsystemThisworkpT-loxp∷spcThespectinomycingeneflankedwithloxpsitesinsertionintoT-easyvectorThislabDH5αF-,φ80d/lacZ⊿M15,⊿(lacZYA-argF)U169,deoR,recA1,endA1,hs-dR17(r-k,m+k),phoA,supE44λ-,thi-1,gyrA96,relA1ThislabJM110psL(StrR),thr,leu,endA,thi-1,lacy,galK,galT,ara,tonA,tsx,dam-,dcm-,supE44(⊿lac-proAB),F'[traD36,proAB,lacIqlacZ⊿M15]ThislabA16D2DerivedfromA16byeliminatingthemega-plasmidpXO2usingplasmidincom-patibility;pXO1+;pXO2-Thislab

表2 本研究所用引物

Tab.2 The primers used in the experiment

PrimerSequence(5'→3')UP-FTTTGGTCTCATGACGAAGCTGGTTTAGGGAGTG(BsaⅠ)UP-RTTTGGTCTCACTCCGGTTAGGAACGTAATCAGTAGA(BsaⅠ)Spc-FTTTGGTCTCAGGAGCTAGTGTTCGTGAATACATG(BsaⅠ)Spc-RTTTGGTCTCACGATTATGCCGATAACTAG(BsaⅠ)DN-FTTTGGTCTCAATCGCAATACACAAATCCGCCAAA(BsaⅠ)DN-RTTTGGTCTCACCAAGATAGATGAGGGAACAATTCG(BsaⅠ)US-FGAGATATTAGCCACTTCCAAGUS-RGGTTCAGATACGACGACTASD-FTTATGGATTCGTCAGAGGAASD-RCGCTATAATATGAGGATGAGGIN-FGACTCCGAACGATCCATATIN-RAGCCGCAACAATAACAGApKSV7P2-FATGTGCTGCAAGGCGATTApKSV7P2-RCCCAGGCTTTACACTTTATG

1.3.3 采用“Golden Gate”克隆体系构建重组打靶载体pK2380usd 采用“Golden Gate”克隆方法，用Ⅱs型限制性核酸内切酶BsaⅠ和T4 DNA连接酶进行目标片段(UP、Spc、DOWN)与受体质粒pKMBK的无缝连接，酶切-连接在同一个管中同步进行。根据各质粒浓度，得到20 μL的反应体系：0.8 μL UP-T、0.8 μL Spc-T、0.7 μL DN-T、0.7 μL pKMBK、0.9 μLBsaⅠ、0.9 μLT4 DNA连接酶、2 μL CutSmart Buffer、2 μL ATP、11.2 μL H2O。此反应全程于冰上操作。混合体系于37 ℃水浴30 min，然后50 ℃水浴5 min，最后80 ℃水浴5 min。取酶切-连接产物5 μL，加至40 μL DH5α感受态细胞中, 轻柔混匀，冰浴30 min，42 ℃热击90 s，冰浴2 min，加入LB培养液1 mL，37 ℃振摇1 h，涂布在含卡那霉素(50 μg/mL)和X-Gal(40 μg/mL)的LB琼脂平板上，30 ℃培养箱过夜。选取白色菌落，用UP-F/R、DN-F/R和Spc-F/R 3对引物进行菌落PCR，验证3个片段UP、DOWN和Spc是否正确连接入受体质粒pKMBK中。对PCR验证正确的克隆提取质粒进行测序，确认构建成功，命名为pK2380usd。

1.4 打靶质粒pK2380usd电转化炭疽芽胞杆菌A16D2

将构建成功的打靶质粒(pK2380usd)首先转入大肠埃希菌JM110中去甲基化，提取质粒电转入A16D2(pXO1+，pXO2-)感受态细胞中(电转条件为电压6 kV/cm，电容25 μF，电阻500 Ω)；然后加入电转复苏液1 mL，30 ℃、200 r/min振荡培养复苏3 h，涂于含Spc(300 μg/mL)的LB琼脂平板上，30 ℃温箱中过夜，挑取单克隆划线培养；最后用pKSV7P2-F/R引物(其扩增序列为pKSV7特有，A16D2基因组没有)确定pK2380usd是否导入A16D2，鉴定正确的菌株命名为pK2380usd/A16D2。

1.5 突变株A16D2ΔBA2380∷spc的筛选

将pK2380usd/A16D2过夜培养菌液按1∶100转接到5 mL无抗生素的LB液体培养基中，30 ℃、225 r/min振荡培养过夜，转42 ℃连续传代5次，稀释至10-3，涂至含有Spc(300 μg/mL)的LB琼脂平板上，30 ℃培养过夜。在平板上挑取单克隆，依次点含Cm(5 μg/mL)、Spc(300 μg/mL)的LB琼脂平板，筛选仅在Spc板上而不在Cm板上生长的克隆(SpcrCms)。将筛选到的阳性克隆(SpcrCms)分别接种于含Cm和Spc的LB液体培养基，再次确认克隆的SpcrCms表型。用1对内部引物(IN-F/R)和2对外部引物(US-F/R、SD-F/R)验证BA2380是否敲除。内部鉴定引物无扩增条带，而2对外部引物均有预期大小特异扩增条带的克隆为阳性克隆，命名为A16D2ΔBA2380∷spc。

1.6 上清液中BA2380及保护性抗原(protective antigen, PA)和致死因子(lethal factor，LF)的表达

分别挑取A16D2和A16D2ΔBA2380∷spc单克隆，接种至含5 mL LB培养基的试管中，37 ℃、225 r/min振荡培养过夜；按1%转接至含100 mL LB培养基的500 mL三角瓶中，37 ℃、225 r/min振荡培养13 h至对数生长末期；上清液经0.22 μm低蛋白结合滤器(Millipore)过滤，采用TCA法收取沉淀[10]。沉淀蛋白用含0.1%二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)(m/V)的8 mol/L尿素溶解后，取50 μL加入截留相对分子质量为10 000的超滤管中，13 000g离心。弃滤过液，加入含0.25%吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)(m/V)的8 mol/L尿素，避光静置30 min。用50 mmol/L碳酸氢铵溶液洗去尿素(离心2～3次，弃滤过液，超滤管中留存体积约为20 mL)，加入10 ng/μL胰蛋白酶(modified，Roche)；酶解12 h后，使用新的离心收集管，离心收集滤过液即为供液相色谱-质谱(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)/MS分析的肽段[11]。每个样品做3个重复实验，用MaxQuant version 1.3.0.5进行Lable-free定量分析[12]。

2 结果

2.1 打靶质粒pK2380usd的构建

spc和BA2380 基因上下游同源臂PCR扩增产

物经1%琼脂糖电泳显示，扩增片段大小为900 bp左右，与预期一致。3个供体质粒UP-T、Spc-T和DN-T与受体质粒pKMBK经本实验室构建的“Golden Gate”克隆体系酶切-连接后，将产物涂布至含卡那霉素和X-Gal的LB琼脂平板上，绝大多数克隆显示白斑，只有很少的克隆显示蓝斑(图1A)。挑选白斑，用UP-F/R、Spc-F/R和DN-F/R进行菌落PCR，均扩增出与预期大小相同的特异条带(图1B)。测序结果经比对分析，证明所构建的打靶质粒pK2380usd完全正确。

A: Culture was plated on LB X-Gal plates with kanamycin. White colonies have undergone the replacement ofpclpB-bgaBwith UP-Spc-DN DNA fragments. B: Identification of the recombinant pK2380usd with three pairs of primers UP-F/R, DN-F/R and Spc-F/R by PCR.

图1 打靶质粒pK2380usd的蓝白斑筛选及PCR验证

Fig.1 Screening of the recombinant plasmid pK2380usd with blue-white cloning and PCR

2.2 A16D2ΔBA2380∷spc阳性克隆的筛选和验证

将从JM110中提取的重组质粒pK2380usd电击转化炭疽芽胞杆菌A16D2感受态细胞，30 ℃培养箱过夜，挑取单克隆菌落进行菌落PCR鉴定，并以炭疽芽胞杆菌A16D2基因组作为阴性对照。结果显示，扩增长度与预期一致，表明打靶质粒成功转入A16D2感受态细胞中。菌株被命名为pK2380usd/A16D2。

将pK2380usd/A16D2菌液接种至5 mL无抗生素的LB培养基中，37 ℃连续传代5次，稀释后涂布至含Spc的LB琼脂平板上，30 ℃培养过夜，在平板上挑取单克隆，经Cm和Spc双抗生素筛选，得到仅在Spc平板上而不在Cm平板上生长的克隆(SpcrCms)(图2A)。将筛选到的阳性克隆(SpcrCms) 分别接种至含Cm和Spc的LB液体培养基，再次确认克隆的SpcrCms表型。结果显示，克隆在含Cm的LB培养基中不生长，而在含Spc的LB培养基中正常生长(图2B)。分别用两对外部引物(US-F/R、SD-F/R)和一对内部引物(IN-F/R)进行菌落PCR验证(图3A)，并提取A16D2ΔBA2380∷spc基因组进行验证。结果显示，两对外部引物分别扩增出相应条带，内部引物没有扩增出相应条带(图3B)，与预期相符。对两对外部引物扩增出的 DNA 片段进行测序， 结果表明所获得的阳性克隆已成功实现了重组，将获得的克隆命名为A16D2ΔBA2380∷spc。

A: Transformants were screened at 30 ℃ on LB plate containing chloramphenicol or spectinomycin. All of the spectinomycin-resistant, chloramphenicol-sensitive colonies had the expected replacement of theBA2380 gene with spectinomycin resistance locus. B: Transformants were screened at 30 ℃ in LB broth containing chloramphenicol or spectinomycin. All of the spectinomycin-resistant, chloramphenicol-sensitive colonies had the expected replacement of theBA2380 gene with spectinomycin resistance locus.

图2 双抗生素(氯霉素和大观霉素)筛选重组克隆

Fig.2 Screening of transformants at 30 ℃ on LB plate and in LB broth containing chloramphenicol or spectinomycin

对上清液中的BA2380蛋白用iBAQ(intensity-based absolute quantification)值进行定量分析，野生株A16D2上清液中BA2380蛋白iBAQ值为19 800 000，且全序列范围被多条肽段匹配(图3C)， A16D2ΔBA2380∷spc的iBAQ值为0， 无匹配肽段(图3D)。这证明BA2380在基因水平的缺失导致蛋白水平没有表达。

A: The position of the primers on the chromosome. B: Identification of theBA2380 mutant strain by PCR with three pairs of primers. C: Peptide coverage of BA2380 in secretory proteome inB.anthracisA16D2. D: Label-free quantification of BA2380, PA and LF proteins between wild-type and mutant-type in secretory proteome (based on iBAQ values).

图3BA2380缺失突变体鉴定结果

Fig.3 Identification of theBA2380 mutant strain

野生株A16D2上清液中LF蛋白的iBAQ值为265 760，而缺失株中iBAQ值为92 722，表达量明显降低。野生株A16D2上清液中PA蛋白的iBAQ值为149 280，而缺失株中iBAQ值为63 858，表达量也有所下降(图3D)。

3 讨论

基因替换是研究基因功能的一个有效手段。在炭疽芽胞杆菌中，基因替换一般根据同源重组的原理进行，将目标基因上下游各一段DNA片段(一般为1 000 bp左右，称为上、下游同源臂)与筛选标记(一般为抗性基因)共同插入到温敏型穿梭载体中，构建同源打靶载体，然后将同源打靶载体导入炭疽芽胞杆菌中，使载体上的两个同源臂分别与炭疽芽胞杆菌染色体上的同源片段发生两次同源重组，使载体上的抗性基因替换炭疽芽胞杆菌染色体上的目标基因，通过抗性筛选及PCR鉴定等方法最终确定基因替换的克隆。构建同源重组打靶质粒一般采用酶切、连接方法，使每个片段逐步连接和鉴定，非常耗时、耗力，有时也存在没有合适位点使用的窘境。

Ⅱs型限制性内切酶能在识别位点外侧切割DNA片段，在5′端或3′端产生4碱基突出，这些突出可根据需要人为设计，理论上共有256种组合，扣除其中的16个回文序列，还有240种可供选择。Engler等于2008年利用Ⅱs型限制性内切酶的这些特性构建了“Golden Gate”克隆方法[13]。该方法包括一个受体质粒和多个供体质粒，受体质粒和每个供体质粒插入片段的接头都是设计好的，可实现无缝连接，且这种连接方法是将所有质粒放在一个酶切-连接体系中，酶切与连接同时进行。自“Golden Gate”克隆方法建立后，迅速应用到多种细菌中，并被证明是一种非常高效的亚克隆方法[14-18]，但目前并未发现其在炭疽芽胞杆菌中应用。本课题组参照Engler的“Golden Gate”克隆方法，构建了能在炭疽芽胞杆菌中进行基因替换的多DNA片段克隆方法。为能在炭疽芽胞杆菌中进行基因替换的遗传操作，选用温敏型的大肠埃希菌-枯草芽胞杆菌穿梭载体pKSV7为骨架质粒，构建“Golden Gate”克隆体系中的受体质粒，对其进行全序列分析，发现了一个内部BsaⅠ位点(本研究中将使用的一个Ⅱs内切酶位点)。为防止对后续实验的影响，本研究采用点突变试剂盒将该位点破坏；为能在后续筛选时使用蓝白斑筛选，引入一个受组成型启动子调控的β-半乳糖苷酶基因，导入到骨架质粒中。该基因两端含有BsaⅠ位点，当酶切-连接体系中供体质粒携带的一系列片段按设计顺序进入受体质粒后，将会替换β-半乳糖苷酶基因，使重组克隆显示蓝斑。为进一步提高筛选效率，本研究在体系中引入抗性筛选标记。在克隆体系中，供体质粒和受体质粒需含有不同的抗性基因才能进行抗性筛选。本研究中的供体质粒为T-easy载体，其非常易得，且PCR片段连接的操作步骤也非常简单。将所有目标片段根据顺序设计一套接头(4碱基突出)，并在引物端加上BsaⅠ位点，将这些PCR片段直接连接入T-easy载体就完成了供体质粒的构建。但该载体含有Ap抗性，与供体质粒相同。本实验室将一个卡那霉素抗性基因导入供体质粒，由此供本研究使用的“Golden Gate”克隆体系构建成功。用此系统进行多DNA片段克隆时，唯一需要做的就是将T-easy载体里的片段换成将要连接的片段，操作非常简单。

本实验室以前的研究结果显示，碱性丝氨酸蛋白酶BA2380可能具有两方面的功能：与S层蛋白的降解及炭疽芽胞杆菌的毒力相关。基于此猜想，本研究采用以上构建的“Golden Gate”克隆体系成功构建了用于基因替换的打靶质粒pK2380usd，这也验证了该克隆系统不仅操作简单，而且非常高效。然后，将打靶质粒电转至炭疽芽胞杆菌A16D2中，实现了对该基因的替换。对上清液蛋白质组进行初步分析，发现炭疽芽胞杆菌毒力大质粒编码的两个重要毒力蛋白PA和LF在缺失BA2380的菌株中分泌量下降，因此BA2380可能与炭疽芽胞杆菌毒力相关。但在上清液蛋白质组中没有鉴定到另一重要毒力蛋白——水肿因子(edema factor，EF)，这可能是由于样品制备条件并非毒力发挥的最佳条件，也可能是由于MS鉴定覆盖率不足。后续实验将模拟体内环境，对BA2380缺失后的毒力蛋白分泌变化进行深入研究。

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s. PENG Qingzhong, E-mail: qzpengjsu@163.com; LIU Xiankai, E-mail: liuxk007@163.com

Construction ofBA2380 deletion mutant ofBacillusanthracisstrain A16D2

JIA Shuhua1,2,*, CHEN Nan2,3,*，WANG Dongshu2, WANG Tiantian2, FENG Erling2, ZHU Li2, WANG Hengliang2, PENG Qingzhong1, LIU Xiankai2

1. Jishou University, Jishou 416000, China; 2. Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China; 3. College of Chemistry and Life Science, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China

The early results of our laboratory showed that BA2380 protein may be related to the virulence ofBacillusanthracis(B.anthracis). The goal of this study is to knock out theBA2380 gene inB.anthracisA16D2 strain. The downstream and upstream sequences ofBA2380 and spectinomycin resistance gene (spc) were obtained with polymerase chain reaction (PCR) respectively and used in the construction of plasmid pK2380usd for gene replacement. pK2380usd was introduced intoB.anthracisA16D2 competent cells, and theBA2380 gene deletion was obtained by antibiotic screening and PCR identification. The results laid a foundation for the subsequent exploration of gene function.

Bacillusanthracis; “Golden Gate” cloning; Gene replacement; Homologous recombination

国家自然科学基金(81271785、81601739)

彭清忠，刘先凯

2016-12-20)

*同为第一作者